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由于腫瘤的高度異質(zhì)性，研究腫瘤發(fā)生的分子機制是非常具有挑戰(zhàn)性的。源自患者的類器官培養(yǎng)是研究癌癥分子機制的強大系統(tǒng)，并在乳腺癌、肺癌等多種癌癥的研究中得到廣泛應用。今天小編就帶大家閱讀一篇在2022年4月28日發(fā)表在Genome Biology（IF：13.583）的文章，看看作者是如何結(jié)合單細胞測序評估結(jié)直腸癌類器官模型的吧！
Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis
通過單細胞RNA-Seq分析對結(jié)直腸癌類器官系統(tǒng)進行系統(tǒng)性評估
一、摘要
從結(jié)直腸癌患者中建立源自患者的類器官，并對來自7名患者的成對樣本進行單細胞RNA-Seq，以獲取類器官及其相應的體內(nèi)腫瘤和正常組織。發(fā)現(xiàn)源自腫瘤組織的類器官忠實地概括了體內(nèi)癌細胞的主要基因表達特征。另一方面，來自正常組織的類器官在整個轉(zhuǎn)錄組水平上表現(xiàn)出一些腫瘤樣特征，但在兩種培養(yǎng)基中都保留了正常的基因組特征，例如 CNV、點突變和正常的全局DNA甲基化水平。這些表明條件培養(yǎng)基在腫瘤上皮細胞的長期培養(yǎng)中優(yōu)于化學成分確定的培養(yǎng)基。最后，相互交換了有機體的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)互換培養(yǎng)基后，有機體細胞基本保持了原來培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)錄組特征。
二、結(jié)果
結(jié)直腸癌類器官的建立和組織病理學表征
建立一組來源于多種類型的CRC患者的手術(shù)切除標本的類器官培養(yǎng)物。其中包括7名CRC患者的7個腫瘤類器官培養(yǎng)物和7對相鄰的正常類器官培養(yǎng)物，并對其進行了高精度的scRNA-Seq分析（圖1A)。其中4名患者的腫瘤和正常來源的類器官在化學成分確定的培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖1A）。與之前的研究一致，作者觀察到來自腫瘤組織的類器官比鄰近的正常來源的類器官呈現(xiàn)出更多樣化的形態(tài)（圖1B）。如圖1B所示，腫瘤類器官的形態(tài)從薄壁囊性到致密結(jié)構(gòu)不等。然后，對這些培養(yǎng)的類器官進行了幾種上皮細胞的免疫熒光染色，結(jié)果表明，培養(yǎng)的類器官如預期的那樣表達了眾所周知的腸上皮細胞標志物（圖1C）。
結(jié)直腸癌類器官的細胞類型組成
基于細胞的全局基因表達模式，將細胞分成三個簇，它們被注釋為上皮細胞、免疫細胞和間充質(zhì)細胞（圖1D-F）。發(fā)現(xiàn)體內(nèi)鄰近的正常組織和正常組織衍生的類器官主要由上皮細胞組成。免疫細胞在體內(nèi)的腫瘤組織中高度富集，但如預期的那樣在腫瘤衍生的類器官中幾乎沒有檢測到（圖1G）。值得注意的是，化學成分確定的培養(yǎng)基也可能促進間充質(zhì)細胞的體外生長，因為它們占化學成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的13.5%（圖1E-G）。此外，進一步分析上皮亞型，共確定了7 種亞型。在整體范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與正常組織或源自正常組織的類器官相比，腫瘤組織或源自腫瘤的類器官具有更多百分比的干細胞樣細胞。此外，體外培養(yǎng)增加了正常來源的類器官中干細胞樣細胞的比例。它表明類器官主要由上皮細胞組成，這意味著體外培養(yǎng)傾向于富集上皮細胞。
相鄰的正常組織衍生的類器官在整個轉(zhuǎn)錄組水平上表現(xiàn)出一些腫瘤樣特征
接下來，研究源自患者的類器官是否可以再現(xiàn)體內(nèi)腫瘤和鄰近正常組織的轉(zhuǎn)錄組特征。作者提取了體內(nèi)腫瘤和正常組織之間的差異表達基因 (DEG)，并分析了它們在體外培養(yǎng)的類器官中的表達模式。結(jié)果表明，體內(nèi)正常上皮細胞和體外正常組織來源的類器官上皮細胞均高度表達了幾種眾所周知的腸道標志物基因（如 CLCA1、PYY、GCG、CA1、CLDN8 和 SI），這反映了正常組織衍生的類器官保持了體內(nèi)腸組織的特征性轉(zhuǎn)錄特征和細胞類型異質(zhì)性（圖2A）。正如預期的那樣，腫瘤衍生的類器官在體內(nèi)高度表達腫瘤特異性基因，其中許多已被廣泛報道與結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，例如 PROCR、SCD、BMP4、CEACAM6、TESC 和 TGFBI（圖2A )。然而，正常組織衍生的類器官也高度表達了這些體內(nèi)腫瘤特異性基因的一部分（圖2A）。此外，對體內(nèi)組織切片和培養(yǎng)中的類器官進行了腫瘤特異性基因CEACAM6的免疫熒光染色（圖 2B，C）。結(jié)果顯示CEACAM6在體內(nèi)僅由腫瘤細胞而非鄰近的正常組織高度表達（圖2B）。然而，培養(yǎng)中的腫瘤和正常組織來源的類器官均高度表達CEACAM6，證實正常組織來源的類器官獲得了結(jié)直腸癌細胞的一些基因表達特征（圖2C）。為了探究基因調(diào)控網(wǎng)絡是否也表現(xiàn)出類似的模式，因此在體內(nèi)和體外樣本中探索了腫瘤特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡。結(jié)果表明，與體內(nèi)正常上皮細胞相比，正常組織和腫瘤來源的類器官均顯示出體內(nèi)癌細胞特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡（圖 3A）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，在RNA、蛋白質(zhì)和基因調(diào)控網(wǎng)絡水平，正常組織衍生的類器官在體外培養(yǎng)后獲得了一些腫瘤樣特征。
不同培養(yǎng)基之間的轉(zhuǎn)錄組特征比較
如圖1F所示，化學成分確定的培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的細胞類型組成不同。因此，進一步探討了這兩種培養(yǎng)基之間基因表達的差異。發(fā)現(xiàn)Wnt信號靶基因AXIN2在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中高表達（圖3B）。此外，另一個Wnt信號靶基因WNT6主要由在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的正常組織來源的類器官表達（圖3B）。接下來，比較了不同培養(yǎng)基和體內(nèi)組織中上皮細胞的干/祖細胞標記基因 (OLFM4) 和分化標志基因 (CA2) 的表達（圖3C）。結(jié)果表明，在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官細胞與體內(nèi)相應的上皮細胞保持了CA2和OLFM4的差異表達模式。在化學成分確定的培養(yǎng)基中，腫瘤組織來源和正常組織來源的類器官細胞混合在一起，CA2和OLFM4的表達沒有顯著差異，表明化學成分確定的培養(yǎng)基有利于正常上皮細胞的干細胞樣特征，而不利于它們的分化/成熟特征（圖3C）。接下來，通過MKI67的表達測量了不同培養(yǎng)基中的細胞增殖。在化學成分確定的培養(yǎng)基中，正常組織衍生的類器官比腫瘤衍生的類器官具有更快的細胞增殖。另一方面，在條件培養(yǎng)基中，正常組織和腫瘤組織衍生的類器官顯示出相當?shù)脑鲋陈剩▓D3D）。這表明化學成分確定的培養(yǎng)基有利于正常上皮細胞的生長，而條件培養(yǎng)基一般對正常上皮細胞和癌癥上皮細胞的生長沒有偏倚。
線粒體突變的譜系追蹤
使用線粒體突變，可以準確區(qū)分體外培養(yǎng)的類器官是來自癌細胞還是來自單細胞分辨率的正常上皮細胞。例如，1號患者體內(nèi)的大多數(shù)癌細胞在6719_G、12948_T 和 7397_G 上具有腫瘤特異性線粒體突變（圖 4A）。患者#1的所有正常組織衍生的類器官在這三個部位都是野生型的（圖 4A）。對于腫瘤衍生的類器官，來自Mix的一些細胞和來自Org-1的所有細胞沒有腫瘤特異性突變，而來自 Org-2、Org-3 的大多數(shù)細胞具有腫瘤特異性突變（圖 4B）。這種現(xiàn)象可以用體內(nèi)腫瘤組織中同時存在癌細胞和正常上皮細胞來解釋，并且它們都在體外生長形成類器官。癌細胞在化學成分確定的培養(yǎng)基中的增殖速度比正常上皮細胞的增殖速度慢得多（圖3D）。因此，接下來比較了在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官中癌細胞的比例。作者發(fā)現(xiàn)長期培養(yǎng)的腫瘤來源的類器官會丟失具有腫瘤特異性突變的細胞，這表明正常上皮細胞生長更快，在體外培養(yǎng)期間，癌細胞逐漸被正常上皮細胞稀釋（圖 4A，H）。在條件培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)的類器官細胞保持腫瘤特異性突變，這表明癌細胞作為條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官的主要群體得到了保持（圖 4D，H）。條件培養(yǎng)基更適合正常上皮細胞和癌細胞上皮細胞的長期培養(yǎng)。研究表明正常組織衍生的類器官表現(xiàn)出一些腫瘤樣特征，因此探索了所有患者上皮細胞中VIM和EPCAM的表達模式（圖4E）。發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)只有一小部分正常上皮細胞共表達VIM和EPCAM。然而，體內(nèi)的腫瘤上皮細胞以及來自正常組織和腫瘤組織的類器官都具有較高比例的共表達VIM和EPCAM的上皮細胞，通過免疫熒光染色在蛋白質(zhì)水平上進一步證實了這一點（圖4G）。這些證據(jù)表明體外培養(yǎng)可能有利于類器官中腫瘤細胞的部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特征。為了排除類器官培養(yǎng)過程中潛在的間充質(zhì)細胞污染，進一步比較了這些 VIM+ 皮細胞和間充質(zhì)細胞之間的VIM表達水平。結(jié)果表明，VIM+上皮細胞中VIM的表達水平僅為間充質(zhì)細胞的一半（圖4F）。因此，推測體外培養(yǎng)可能會促進類器官中的EMT。
培養(yǎng)的類器官保留了體內(nèi)相應組織的基因組和全局DNA甲基化特征
接下來，檢查了類器官中的突變和CNV，發(fā)現(xiàn)正常組織衍生的類器官不包含CNV或腫瘤特異性點突變。除了研究CNV和突變外，作者還研究了在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的體內(nèi)組織和類器官的整體DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)類器官可以維持體內(nèi)相應組織的全局DNA甲基化水平。
類器官培養(yǎng)基的交換
為了進一步驗證細胞增殖和干/祖細胞特征維持的差異是由不同的培養(yǎng)基引起的，在后續(xù)實驗中更換了類器官的培養(yǎng)基，并對這些細胞并列進行了高精度的單細胞RNA-Seq（圖5）。結(jié)果表明，類器官細胞在換用另一種培養(yǎng)基后，在原培養(yǎng)基中保持了OLFM4和CA2的表達模式（圖5A-B）。正常組織衍生的類器官和腫瘤組織衍生的類器官都高度表達體內(nèi)腫瘤特異性標記基因CEACAM6（圖 5C 和 E）。此外，交換培養(yǎng)基不影響上皮細胞的基因組特征（圖5D、F）。
總結(jié)
作者在兩種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的體內(nèi)組織和相應類器官進行單細胞RNA測序，結(jié)合基因組和DNA甲基化組測序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地評估了類器官培養(yǎng)系統(tǒng)在分析結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生的分子特征方面的可靠性。生物信息大數(shù)據(jù)分析助力實驗的工作正在如火如荼的開展，感興趣的小伙伴千萬不要錯過了呦！
