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內質網應激的癌細胞如何調節抗腫瘤免疫？
在遭受內質網(ER)應激的癌細胞中，未折疊蛋白反應(unfolded protein responses, UPRs)的激活促進了癌細胞的生存。然而，腫瘤細胞中的UPR如何影響抗腫瘤免疫反應的研究仍然很少。今天分享一篇2022年10月發表在Cancer Cell（IF=38.585）的文章。這篇文章分析了腫瘤細胞來源的PERK(pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase)如何促進免疫逃避，并強調了PERK靶向療法在癌癥免疫治療中的潛力。
研究背景
大多數腫瘤患者發生的免疫功能改變已成為惡性細胞進展和轉移的主要驅動因素，也是開發抗癌療法的主要限制因素。免疫細胞暴露于腫瘤微環境(TME)中的活性化合物和代謝條件，啟動了不同的應激誘導信號通路，這些信號通路可能會限制其抗腫瘤潛力。癌細胞中應激誘導的信號通路與保護性抗腫瘤免疫調節之間的相互作用仍不清楚。
內質網(ER)應激是由多種應激源引起的，包括內質網腔內錯誤折疊蛋白的積累、營養剝奪、低氧、治療藥物和炎癥因子。為了應對內質網應激，癌細胞會激活一個被稱為未折疊蛋白反應(UPR)的綜合信號網絡，其特征是胰腺內質網激酶(PKR)類內質網激酶(PERK)、肌醇所需酶-1a (IRE1a)和激活轉錄因子6 (ATF6)的激活。
腫瘤細胞死亡過程已成為抗腫瘤免疫的關鍵調節因子。在局部和遠處釋放抗免疫應答的癌細胞死亡過程被歸為免疫原性細胞死亡(ICD)，其特征是細胞內ATP和HMGB1(high-mobility group box protein 1)的釋放、ExoCRT(externalization of calreticulin to the cell membrane)和I型干擾素(IFNs)的產生。盡管ICD是一種有效的治療腫瘤相關免疫逃避的策略，但誘導ICD以及ICD如何實現保護性抗腫瘤免疫的機制仍不清楚。
這篇文章的目的是闡明癌細胞中PERK激活和腫瘤宿主中免疫逃避之間的交互作用。黑色素瘤細胞中PERK的缺失或抑制限制了它們在ER應激后的生存能力，并導致凋亡介導的ICD，刺激腫瘤內樹突狀細胞（DCs）產生I型IFN，從而激起單核細胞前體（cMoPs）分化為Ly6C + CD103 +單核細胞系炎癥DCs（MoDCs）和T細胞免疫。這些結果支持了針對黑色素瘤的PERK的免疫治療潛力。
主要結果
癌細胞中的PERK會限制保護性抗腫瘤T細胞免疫
黑色素瘤中PERK信號通路是否影響臨床預后和抗腫瘤免疫仍不清楚。為了在缺乏PERK磷酸化信息的情況下評估PERK活性與臨床結局的關系，作者根據Connectivity Map平臺中A375黑色素瘤細胞系中的EIF2AK3 (PERK編碼基因)沉默后減少的前250個轉錄本開發了PERK活性mRNA signature。研究表明，與腫瘤PERK信號低的患者相比，具有高PERK信號mRNA signature的腫瘤患者的總生存期較短(圖1A)。作者還測試了黑色素瘤中的PERK信號是否影響ICI的療效。對接受抗pd -1和/或抗ctla -4治療的68例黑色素瘤患者隊列進行的回顧性分析表明，與PERK信號轉導較低的腫瘤患者相比，PERK信號轉導較高的腫瘤患者的ICI應答較為不良(圖1B)。因此，人類黑色素瘤中的PERK信號限制了ICI的臨床療效和反應。作者評估了人類黑色素瘤細胞中的PERK激活是否影響腫瘤內T細胞的擴增。在133例轉移性黑色素瘤中，對黑色素瘤細胞(SOX10 +)中磷酸化PERK的表達進行了分層，結果與腫瘤內T細胞的頻率相關(圖1C)。SOX10 +細胞中磷酸化PERK的高表達與腫瘤中CD4 +和CD8 + T細胞的比例降低相關(圖1D)，提示黑色素瘤細胞區室中的PERK磷酸化抑制了人腫瘤中的T細胞擴增。為了確定腫瘤細胞內的PERK是否影響抗腫瘤免疫作用，研究人員建立了兩個PERK缺失(PERK KO)的黑色素瘤細胞系（SM1 和B16）。在體內，與Scramble或野生型(WT)對照相比，在分別植入PERK KO SM1 和B16腫瘤的C57BL/ 6小鼠中，腫瘤生長明顯延遲 (圖1E和圖1F)。腫瘤細胞選擇性缺失一個或兩個Eif2ak3等位基因延遲了腫瘤生長 (圖1G)。在Rag1-對照組小鼠中或在接受抗cd4或抗cd8抗體治療的WT小鼠中，由B16或SM1細胞中PERK缺失所觸發的抗腫瘤效應被部分阻止 (圖1H和1I)，提示T細胞在PERK KO腫瘤中的抗腫瘤作用。與對照腫瘤相比，攜帶PERK KO B16細胞的小鼠的腫瘤顯示出更高比例的CD8 +和CD4 + T細胞、primed CD69 + CD44 + CD8 + T cells、多功能IFN-g + TNF-a + CD8 + T細胞和黑色素瘤抗原gp100特異性EGSRNQDWL- H-2D b -tetramer + CD8 + T細胞，但巨噬細胞、B細胞或NK細胞沒有(圖1J-1M)。在他莫西芬處理的小鼠的病變中，發現了類似的自發膨脹的gp100反應性CD8+ T細胞的升高（圖1N）。與對照組相比，在PERK KO腫瘤的腫瘤內CD8 + T細胞中檢測到更高的PD-1水平（圖1O）。 另外，與同型處理的PERK KO腫瘤或抗PD1處理的對照組相比，用抗PD-1治療PERK KO B16小鼠的抗腫瘤效果增強了（圖1P）。為了驗證治療模型中PERK的缺失，作者接下來測試了AMG44的抗腫瘤作用，這是一種強效和選擇性的PERK抑制劑。抑制PERK影響了小鼠自體黑色素瘤的生長（圖1Q）。AMG44治療還可以延緩B16腫瘤的進展和誘導SM1腫瘤的排斥反應（圖1R）。因此，抑制PERK抑制了腫瘤生長并誘導了腫瘤特異性T細胞的擴增。
ER應激腫瘤細胞的PERK消融可引起非凋亡性細胞程序性死亡
為了了解在癌細胞中清除PERK所誘導的免疫刺激效應，作者研究了內質網應激后PERK在腫瘤細胞存活中的作用。與對照組相比，PERK KO腫瘤對內質網應激誘導的細胞死亡表現出更高的易感性，這表明在Thaps治療后，通過DiOC2(3)檢測到Annexin V的結合和線粒體膜電位的去極化更高(圖2A)。細胞死亡程序沒有在內質網應激的PERK KO腫瘤細胞死亡中發揮必要作用。值得注意的是，與接受相同治療的Scramble對照組相比，PERK KO黑色素瘤細胞在Thaps治療后發生了ER腫塊增大、錯誤折疊蛋白積累擴大、維持主動翻譯以及活性氧簇(ROS)水平增加(圖2B-2D)。此外，在內質網應激源Thaps或衣霉素、饑餓葡萄糖或血清或TES的作用下，PERK KO B16細胞表現出獨特的細胞形態，其特征是廣泛的細胞質空泡化、完整的細胞核和細胞黏附保留(圖2E)。在來自小鼠的PERK KO B16腫瘤中，或在不同應激源(包括Thaps、TES或血清饑餓)的體外治療后，發現更高水平的SEC61b (圖2F)。此外，與相同處理的模擬對照相比，SEC61b沉默阻止了Thaps治療的Annexin V增加和PERK KO腫瘤中與下垂相關的形態(圖2G, 2H)，表明SEC61b在內質網應激后PERK KO腫瘤細胞死亡中的作用。接下來，作者研究了ATF4在PERK敲除腫瘤中發生的細胞凋亡中的作用。在PERK KO腫瘤中，作者發現ATF4 在unresolved內質網應激誘導的SEC61b介導的細胞死亡中發揮潛在作用(圖2I)。作者還評估了SEC61b在ICD驅動基因表達中的作用。Thaps處理后，與對照組相比，PERK KO B16細胞顯示出更高的ICD hallmarks，包括ATP和HMGB1的釋放，以及ExoCRT的誘導(圖2J, 2K)。此外，Sec61b siRNA阻斷了Thaps處理的PERK KO B16細胞中ATP的釋放和ExoCRT的誘導(圖2L和2M)，表明在ER應激的PERK KO腫瘤中，Sec61b驅動的非凋亡性細胞程序性死亡在ICD介質的釋放中具有上游效應。
黑色素瘤PERK消融可驅動ICD遠端抗腫瘤免疫
對來自小鼠的PERK KO B16細胞的分析表明，與對照組相比，ER增大和蛋白聚集增加，以及細胞外ATP、HMGB1和ExoCRT的產生增加(圖3A-3E)。此外，與對照組相比，在大量PERK KO腫瘤中檢測到I型IFN連鎖轉錄物Ifnb1、Isg15和Ifit3的升高 (圖3F)。與ICD評分降低的腫瘤患者相比，ICD mRNA signature升高的腫瘤患者有較長的總生存期 (圖3G)，提示ICD對人類黑色素瘤產生影響。為了證實在PERK敲除腫瘤小鼠中ICD的激活，作者測試了遠端部位的全身抗腫瘤效應。植入WT或PERK KO SM1腫瘤10天的小鼠被注射另一個位于對側的WT或PERK KO SM1腫瘤，結果表明腫瘤中PERK的缺失觸發了抗腫瘤遠隔效應(圖3H)。接下來，作者評估了針對PERK KO腫瘤的記憶反應的發展。與未患腫瘤的小鼠相比，之前排斥PERK KO SM1腫瘤的C57BL/6小鼠對WT SM1細胞完全耐藥(圖3I)。然而，這一保護作用并未發生在無關的 Lewis肺癌腫瘤中(圖3J)，表明誘導了保護性腫瘤特異性免疫記憶。
腫瘤中PERK的消融會刺激MoDCs的擴增
荷瘤宿主異常的骨髓造血促進MDSCs的擴增，限制免疫刺激DCs的成熟和功能。與Scramble和WT對照相比，在B16 PERK KO腫瘤中發現MDSCs比例和T細胞抑制活性降低，同時DC頻率較高(圖4A, 4B)。作者接下來研究了CD11c + DC在PERK KO腫瘤中的抗腫瘤作用。白喉毒素(DT)治療后，Itgax DTR/EGFP小鼠中的CD11c + -DC缺失恢復了B16 PERK KO腫瘤的生長，而Scramble對照中的生長延遲(圖4C)。與來自Scramble對照的DCs相比，來自PERK敲除B16腫瘤的DCs在共培養的初始Pmel CD8 + T細胞中誘導了活化標志物CD44和CD69的高表達，這與PERK敲除B16腫瘤的DCs將腫瘤抗原提呈給T細胞的能力一致(圖4D)。這些結果表明，DCs在促進PERK KO腫瘤的抗腫瘤反應中發揮關鍵作用。與Scramble或WT對照相比，在PERK KO B16腫瘤中檢測到的MoDCs比例增加，而不是傳統DC(cDC1和cDC2)(圖4E)。在他莫昔芬暴露的Braf V600E/+黑色素瘤中也發現了增加的MoDCs擴增 (圖4F和圖4G)。此外，B16腫瘤細胞中的PERK缺失增加了共刺激分子CD80、CD86和CD40在腫瘤內MoDCs中的表達，而不改變它們在cDC1和cDC2亞群中的表達(圖4H)。與cDC1或cDC2相比，MoDCs在TME內顯示出較高的eGFP表達，這一情況在Scramble和PERK KO腫瘤中相似(圖4I)。這些結果表明，在PERK敲除的腫瘤中，MoDCs擴增，具有更高的吞噬腫瘤產物的能力和免疫刺激潛能。
腫瘤細胞中的PERK控制髓樣前體細胞向MoDCs的分化
據報道，MoDCs可由骨髓、脾臟和腫瘤中擴增的cMoPs產生。雖然在骨髓中未發現變化，但與Scramble對照相比，在攜帶PERK KO B16腫瘤的小鼠中，檢測到脾臟和腫瘤中cMoPs的頻率較高(圖5A)。與perk活性對照相比，在缺乏Eif2ak3或接受AMG44的他莫昔芬治療的小鼠中，作者發現腫瘤cMoPs有類似升高(圖5B)。與對照組相比，在攜帶PERK KO B16腫瘤的小鼠的腫瘤和脾臟中檢測到表達MoDC標志物的cMoPs比例增加(圖5C)。與輸送到Scramble對照組的相同前體相比，在PERK KO腫瘤中檢測到獲得MoDC標記的轉移cKit +細胞的頻率升高。(圖5D)。表明在PERK敲除的荷瘤小鼠中，cMoPs進入MoDC中(圖5E）。接下來，作者評估了脾源性cMoPs在PERK缺失誘導的抗腫瘤效應中的作用。在B16腫瘤中，在注射腫瘤之前切除小鼠脾克服了抗腫瘤作用，并抑制了PERK缺失誘導的腫瘤相關cMoPs和MoDCs的擴增(圖5F-5H)。在攜帶PERK KO腫瘤的脾切除小鼠中，脾cKit +細胞的轉移進一步增加了腫瘤內cMoPs和MoDCs的擴增(圖5G和5H)。結果表明，脾臟來源的cMoPs在腫瘤MoDCs中的擴增和在PERK KO腫瘤中觀察到的抗腫瘤作用中發揮作用。作者確定了調節cMoPs遷移到PERK敲除腫瘤的介質。與對照組相比，PERK KO腫瘤中CCL2、CCL12、CXCL10、CCL21和CCL11水平升高(圖5I)。與對照相比，來自PERK KO腫瘤的cMoPs顯示出較高的CCR2表達(圖5J)。此外，使用CCR2拮抗劑BMS-CCR2- 22對攜帶PERK KO b16的小鼠進行治療后，恢復了腫瘤生長，并損害了cMoPs和MoDCs的瘤內擴增(圖5K)。類似地，小鼠中的CCR2缺失挽救了PERK KO腫瘤的生長，并抑制了PERK KO腫瘤中cMoPs和MoDCs的累積(圖5L和5M)，這提示CCR2在cMoPs歸巢至PERK KO腫瘤中的作用。
I型IFN信號驅動PERK KO腫瘤的抗腫瘤免疫
為了研究Scramble和PERK KO腫瘤中髓系前體細胞的差異，作者通過RNA-seq比較了瘤內cKit +細胞。在攜帶PERK KO B16小鼠的cKit +前體中，發現了與MoDC功能和I型IFN信號傳導相關的明顯誘導轉錄物(圖6A, 6B)。與同型處理的對照相比，抗IFNAR1治療恢復了PERK KO腫瘤的生長，并完全阻止了cMoPs和MoDCs的擴增(圖6C和6D)，表明IFNAR1在PERK KO抗腫瘤效應中的主要作用。考慮到死亡的腫瘤細胞可能代表I型IFN的來源，作者接下來測試了在PERK KO腫瘤細胞中I型IFN的產生和信號傳導。基于CRISPR-Cas9的Ifnb1缺失(IFN-b1 KO)未能恢復小鼠PERK KO B16腫瘤的生長(圖6E)，這表明內在的IFN-b1生成在生長延遲的PERK KO腫瘤中沒有發揮作用。為了研究宿主來源的I型IFN信號傳導的作用，研究人員將Scramble和PERK KO腫瘤移植到ifnar1缺失的小鼠中。發現注射到ifnar1缺陷小鼠的PERK KO腫瘤生長恢復，cMoPs、MoDCs和gp100反應性CD8 + T細胞的擴增被抑制(圖6F-6H)。此外，與對照組相比，在注射到ifnar1缺失小鼠的PERK KO腫瘤中，cmp遷移驅動因子CCR2的表達水平較低，Ccl2 mRNA水平也較低(圖6I)。結果證明了宿主來源的IFNAR1信號通路在PERK敲除腫瘤中增強的抗腫瘤免疫反應中的作用。
DC中的I型IFN通過STAT1啟動cMoPs向MoDCs的轉移
鑒于多個間質亞群可以分泌I型IFN，作者使用IFN-b1-EYFP小鼠來測試I型IFN在PERK KO腫瘤中的產生。雖然巨噬細胞、MDSCs和cMoPs在Scramble和PERK KO腫瘤中具有相似的IFN-b1-EYFP表達，但與對照組相比，PERK KO腫瘤中的DC具有更高的IFN-b1-EYFP表達(圖7A)。在DC中，與cDC1或cDC2相比，來自PERK KO B16腫瘤的MoDCs表現出更高的IFN-b1-EYFP表達(圖7B)。此外，來自患Scramble和PERK KO腫瘤小鼠的脾臟MoDCs未顯著表達IFN-b1水平(圖7C)，這表明IFN-b1誘導優先發生于腫瘤內MoDCs。接下來，作者確定了暴露于PERK KO腫瘤釋放的ICD介質是否能刺激DC產生IFN-b1。與Thaps外植體培養的DC或溶劑處理的Scramble對照培養的DC相比，暴露于Thaps預處理的PERK KO B16細胞的上清液中來自脾臟或來源于骨髓的DC的IFN-b1-EYFP表達較高(圖7D)。為了評估ICD驅動因子在IFN-b1誘導中的具體作用，作者中和了與DNA、HMGB1或ATP相關的信號傳導。值得注意的是，在暴露于ER應激的PERK KO腫瘤的上清液的DC中，使用ATP應答性P2X嘌呤受體(P2XRs)、伊文藍(EvB)或磷酸吡啶-6-偶氮苯基- 20,40 -二磺酸的拮抗劑以及抗HMGB1治療可損害IFN-b1-EYFP的誘導(圖7E)。因此，內質網應激PERK敲除的腫瘤釋放ICD相關的ATP和HMGB1，從而觸發IFN-b1在MoDCs中的表達。
為了進一步驗證在PERK敲除的腫瘤中，cMoPs 向MoDCs的分化是由I型IFN連接的信號調節，研究人員聚焦于STAT1，它被IFNAR1信號激活并影響DC發育。PERK KO b16腫瘤的cMoPs中磷酸化STAT1水平升高，這也依賴于IFNAR1的表達(圖7F)。此外，與Scramble對照相比，來自PERK KO B16腫瘤的cKit +細胞的GSEA發現，受STAT1調控的基因的mRNA表達較高。為了測試激活的STAT1是否促進cMoPs 向MoDCs轉移，作者用STAT1抑制劑氟達拉濱處理熒光標記的cKit +前體，然后將它們轉移到Scramble或PERK KO B16腫瘤中。同樣，將熒光標記的cKit +前體從STAT1敲除小鼠轉移到腫瘤中，并評估它們向MoDCs的分化。在PERK KO腫瘤中，STAT1抑制或缺失損害了轉移的前體細胞向MoDCs的分化(圖7G和7H)。這些結果證實了IFNAR1信號通路相關的STAT1在PERK敲除腫瘤中cMoPs 向MoDCs遷移中的作用。
三．總結
本文主要研究了癌細胞對內質網(ER)應激的適應如何調節抗腫瘤免疫。在黑色素瘤細胞中，清除內質網應激相關激酶PERK可通過類凋亡介導的免疫原性細胞死亡激活保護性T細胞應答，通過I型IFN-STAT1啟動單核系炎癥DCs的擴增。總之，這項研究的結果證明了PERK信號在腫瘤細胞逃避保護性免疫中的關鍵作用。
參考文獻：
Mandula JK, Chang S, Mohamed E, Jimenez R, Sierra-Mondragon RA, Chang DC, Obermayer AN, Moran-Segura CM, Das S, Vazquez-Martinez JA, Prieto K, Chen A, Smalley KSM, Czerniecki B, Forsyth P, Koya RC, Ruffell B, Cubillos-Ruiz JR, Munn DH, Shaw TI, Conejo-Garcia JR, Rodriguez PC. Ablation of the endoplasmic reticulum stress kinase PERK induces paraptosis and type I interferon to promote anti-tumor T cell responses. Cancer Cell. 2022 Oct 10;40(10):1145-1160.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2022.08.016. Epub 2022 Sep 22. PMID: 36150390; PMCID: PMC9561067.
