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癌癥免疫治療的目的是激活抗原特異性T細胞，以促進其抗腫瘤活性。例如，免疫檢查點抑制劑的阻斷療法改善了很多實體瘤如肺癌、腎癌等患者的預后。但是實際上，已有文獻報道并不是所有的T細胞群體都會被免疫檢查點抑制劑激活，只有一小部分T細胞對PD1/PD-L1抑制劑敏感。今天給大家分享一篇2022年4月12日發表在Cancer Cell（IF:31.743）上，前體組織駐留記憶T細胞控制卵巢癌的免疫原性的文章。接下來讓我們一起看看這一小部分前體組織駐留記憶T細胞具有怎樣特異的功能以及怎樣調控卵巢癌的免疫原性的呢？

Ovarian cancer immunogenicity is governed by a narrow subset of progenitor tissue-resident memory T cells

前體組織駐留記憶T細胞控制卵巢癌的免疫原性

一．研究背景

癌癥免疫治療的目標是重新激活抗原特異性T細胞，以促進其抗腫瘤活性。而腫瘤使得了活化以及未活化的T細胞呈現出代謝障礙，免疫檢查點抑制劑阻斷治療改變了多種實體腫瘤的預后。在腫瘤抗原刺激下，許多腫瘤反應性T細胞作為組織駐留記憶（TRM）樣T細胞在周圍組織中長期駐留。在瘤床上，表達TCF1的干細胞樣CD8⁺ T細胞，是一種TIM3 ^- IL7R ⁺CD8⁺ T細胞，與PD1⁺ TIM3⁺ CD8⁺ T耗竭型細胞共存。T細胞受體（TCR）在干細胞樣和終末分化T細胞中具有顯著重疊部分，這說明干細胞樣腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）可以逐步分化成終末耗竭的TILs。由于TRM樣CD8⁺ T細胞通常缺乏淋巴結歸位受體CCR7，TRM樣TILs和干細胞樣TILs仍是屬于不同的群體。在卵巢癌中，免疫檢查點阻斷治療未能很好地改善患者的預后，這引起了研究人員對卵巢癌免疫原性的質疑。因此，本研究確定了卵巢癌患者中的TILs可以特異性識別腫瘤抗原，并且起到主要作用的是一小群具有干細胞樣TRM樣CD8⁺ T細胞。

二．研究方法

該工作闡述了卵巢癌浸潤性CD8⁺ T細胞的腫瘤識別功能主要取決于于組織駐留記憶（TRM）CD8⁺ T細胞。該研究對83, 454個CD3⁺CD8⁺CD103⁺CD69⁺ TRM細胞進行了scRNA-seq、scTCR-seq以及scATAC-seq測序和122個高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）的免疫組化實驗結果表明，只有前體組織駐留記憶CD8⁺ T細胞（TCF1 ^low TRM _stem ）可以預測卵巢癌的預后。

三．研究結果

1、TRM樣CD8⁺ TILs表現出胞啃特征，可以識別不同的抗原，并表現出優越的抗腫瘤活性

為了鑒定能夠識別腫瘤抗原的TILs，該工作重點研究了CD8⁺ T細胞，這些細胞表現出胞啃誘導的來自于卵巢癌細胞的EpCAM蛋白轉移的跡象。熒光激活細胞分選（FACS）分析和多光譜成像流式細胞術檢測發現約有1% ~ 4%的CD3⁺CD8⁺ TILs與EpCAM共染色，但在T細胞的mRNA水平上未檢測到EpCAM的表達（圖1A, 1B）。有趣的是，EpCAM⁺ TILs也表達CD103和CD69（圖1C），呈現TRM樣 CD8⁺ T細胞相關的標記基因,它可以預測卵巢癌中更好的生存。這些細胞共表達CD49a，占HGSOCs樣本浸潤的CD8⁺ TILs的60%（圖2A）。為了鑒定TRM淋巴細胞的其他特征，比較了來自相同腫瘤的（CD3⁺ CD8⁺ CD103⁺ CD69⁺ CD49a⁺）TRM樣CD8⁺ T細胞與（CD3⁺ CD8⁺ CD103^-）循環CD8⁺ T細胞（圖2A）。TRM樣CD8⁺ T細胞顯示T細胞耗竭標志物如PDCD1、LAYN、CTLA4、TIGIT、TOX和HAVCR2的高表達（圖2B），暗示了同源抗原的長期暴露。TRM樣CD8⁺ T細胞也表現出較高的效應基因表達，包括IFNG和GZMB，但較低水平的干細胞標志物，如TCF7、IL7R、LEF1、CCR7和CD28。TRM樣T細胞也過表達CXCL13，與惡性腫瘤中的B細胞募集和新抗原負荷相關（圖2B）。為了進一步支持TRM樣CD8⁺ T細胞與抗原的反復接觸結合，差異通路分析鑒定到有絲分裂細胞周期進展特征，以及克隆擴增和腫瘤缺氧相關特征（圖2C）。為了證實腫瘤反應性CD8⁺ T細胞屬于組織駐留型CD8⁺ T細胞，該研究分析了HGSOCs樣本的TRM樣CD8⁺ TILs和循環CD8⁺ TILs的TCR免疫組庫。平均而言， TRM樣CD8⁺ TILs和循環CD8⁺ TILs中共享~12.5%的TCR - β鏈（圖2D）。正如預期的那樣，TRM樣CD8⁺ TILs具有較高的克隆多樣性（圖2E）。為了從功能上驗證TRM樣CD8⁺ TILs在體內的保護作用，將OVA特異性的OT-I T細胞轉移到同源小鼠發育的側面OVA^low-UPK10卵巢腫瘤中（圖2F）。7天后，40%的腫瘤抗原特異性TILs具有TRM樣表型，其余的仍為循環CD8⁺ TILs（圖2G）。TRM樣表型的形成依賴于抗原的刺激，因此，未致敏的OT-I T細胞在OVA^neg腫瘤中無法獲得TRM樣的特征（圖2H）。最重要的是，從分離的腫瘤中恢復的CD103⁺ CD69⁺ 腫瘤抗原特異性TRM樣TILs比CD103^- OT-I T更有效地抑制了不同的OVA^low腫瘤的生長（圖2I，J）。綜上所述，這些結果表明，在人類卵巢癌中，TRM樣CD8⁺ TILs和循環CD8⁺ TILs表現出不同的表型和克隆多樣性，并且TRM樣CD8⁺ TILs在瘤床上表現出優越的抗腫瘤活性。

2. TRM樣CD8⁺ TILs呈現從干細胞樣T細胞分化為耗竭T細胞的軌跡

對19193個CD103⁺CD69⁺CD8⁺ TRM樣CD8⁺ TILs和24175個循環CD8⁺ TILs進行了單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），并結合VDJ分析，根據基因表達譜和TCR相似性，確定了CD103⁺ CD69⁺ TRM樣CD8⁺ TILs的分化軌跡，CD103^-CD69⁺循環CD8⁺ TILs轉化為TCF7^low IL7R⁺CCR7⁺CD38^- CD8⁺ T細胞，并保留干性特征（TRM_stem）。這些干細胞樣CD8⁺ T細胞分化為GZMB⁺PRF1⁺GNLY⁺ZNF683⁺ TRM樣效應CD8⁺ T細胞（TRM_eff），然后分化為TIGIT^lowHAVCR2^+/lowHLA-DR^highENTPD1^+/low TOX⁺ TRM樣具有高增殖特征的CD8⁺ T細胞（TRMprol），后轉化為耗竭的PD-1^high HAVCR2^highTIGIT^highENTPD1^highHLA-DR⁺TOX⁺CD8⁺ T細胞（TRMexh）（圖3A、3B）。并通過對同一細胞的基因表達和開放染色質的同時分析進一步證實，在這些位點上顯示了同步的核RNA表達、富集的開放染色質區域和基因活性（圖3B-3E）。這些整合分析揭示了多個共調控基因模塊，包括與T細胞干細胞相關的基因（IL7R, CD28, CCR7, CD27, CXCR5），與T細胞效應活性相關的基因（GZMB, GNLY, PRF1, IFNG），與T細胞增殖相關的基因（STMN1, MCM7, TOP2A, CDK1, DNMT1），以及與T細胞耗竭/功能障礙相關的分子（PDCD1, HAVCR2, TIGIT, CTLA4）。還發現了在特定TRM樣亞群中差異表達的新標記，例如，在TRMeff/TRMprol/TRMexh分化過程中ETV1的表達逐漸增加。相比之下，GZMK的表達水平在TRM_stem細胞中最高，并在耗竭過程中逐漸降低（圖3B）。該分析還顯示，鋅指DNA結合域（ZNF, KLF, SP）在TRM_stem細胞中富集，而與核受體和同源結構域（如POU結構域）相關的motif在更分化的TRM樣亞群中富集，在TRM_exh細胞中FOX和HOX結構域增加（圖3F）。進一步的scVDJ分析/RNA-seq分析顯示， TRM樣CD8⁺ TILs和24175個循環CD8⁺ TILs共用13%的TCR（圖3G），然而TRM_stem與其他TRM樣細胞群共享24%的TCR。這些樣本中35%的TILs分化為TRM_eff和TRM_exh細胞，沒有TRM_stem細胞（圖3G）。然而，TRM_exh表現出典型耗竭T細胞特征HAVCR2/TOX/ENTPD1/CTLA-4的表達（圖3H）。TRM_stem細胞中也發現有16%的TCR在TRM_exh細胞和其他非干細胞類TRM樣細胞群之間共享，類似于感染模型中的干細胞類T細胞，TRM_stem細胞的ATAC-seq圖譜中沒有顯示出耗竭的跡象（圖3H）。

3. TRM_stem預測卵巢癌患者預后

為了進一步確認TRM_stem TRM_eff TRM_prol TRM_exh的分化軌跡,進行了額外的scRNA-seq測序,聯合VDJ分析了60010個 TRM樣 CD8 ⁺ T細胞（圖4A）。正如預期，與其他TRM樣亞群相比，TCF1⁺ TRM_stem細胞表現出較低的CD103表達（圖4B、4C）。然而，它們也表達TRM樣分化的標志物，包括編碼CD49a的ITGA1、RUNX3以及編碼LFA-1的兩個亞基的ITGAL和ITGB2。TRM_stem細胞也表達干細胞樣細胞標志物，包括IL7R、CD28和CCR7。與針對特定腫瘤抗原的長期反應一致，TRM_exh細胞表現出最高的克隆多樣性（圖4D和4E）。在這些腫瘤中，57.7%的TRM樣克隆型與TRM_stem細胞共享998個TCR（圖4F、4G）。考慮到只有40%的非冗余TCR存在于TRM樣TILs中（而在循環淋巴細胞中這一比例為67%），具有TRM_stem免疫組庫和分化的TRM樣細胞的克隆型僅占TCR的3%（相當于13.4%的CD8⁺ TILs）。綜上所述，這些結果表明，只有一小部分循環CD8⁺ TILs可轉化為TRM_stem，隨后產生TRM_eff/ TRM_prol/ TRM_exh CD8⁺ T細胞。為了驗證TRM_stem TILs在人卵巢癌中的保護作用，接下來對122個不同注釋的HGSOCs進行了多重免疫熒光（圖5A, B）。TRM樣CD8⁺ TILs與循環CD8⁺ TILs的高比率與總體生存改善相關（圖5C）。值得注意的是，TRM樣CD8⁺ TILs主要位于腫瘤胰島內，而循環CD8⁺ TILs分散在基質和腫瘤細胞中（圖5D）。表達TRM_stem標記物TCF1的CD3⁺ CD8⁺ CD103^low CD69⁺ TRM樣CD8⁺ TILs的腫瘤浸潤也與改善的預后密切相關（圖5E）。相反，TCF1⁺ CD103^- CD8⁺ 干細胞樣循環CD8⁺ TILs細胞（圖5F），或TCF1⁺ CD103⁺ CD8⁺ CD69⁺ 循環CD8⁺ TILs細胞（圖5G）則不能顯著影響預后。類似地，CD103⁺ CD69⁺ CD8⁺ （分化的TRM樣）TILs與預后也無顯著相關性（圖5H）。不同細胞類型間的相互作用分析顯示，盡管TRM_stem細胞也與CD69⁺循環CD8⁺ TILs聚集在一起，但TRM_stem細胞與其他TRM樣細胞之間存在很強的相關性（圖5I，J）。這些實驗證實了TRM樣細胞的線性分化軌跡，同時也表明TRM樣TILs與更好的預后之間的聯系取決于TRM_stem細胞。

4. T細胞致敏的性能和同源抗原的持久性激活維持了抗腫瘤反應性TRM_stem的活性

該研究在體外使用不同劑量的抗原激活OVA特異性T細胞但這并不影響其在OVA⁺腫瘤中的積累，以及腫瘤反應性TRM樣T細胞的比例，或TRM_stem/TRM_eff的平衡（圖6A, B, C）。然而，腫瘤抗原特異性T細胞需要抗原提呈細胞的激活才能在腫瘤中聚集，這表明是T細胞的TME發生代謝性麻痹后無反應（圖6D）。為了闡明抗原親和性在TRM_stem分化中的作用，接下來比較了在體外被OT-1 TCR同源抗原(SIINFEKL)激活的OT-I T細胞與低親和性配體Q4H7 (SIIQFEHL)和G4 (SIIGFEKL)之間的表型差異。低親和力性配體SIIQFEHL或SIIGFEKL的激活降低了腫瘤反應性OT-I細胞在腫瘤中積聚的能力（圖6E）和進行TRM樣分化的能力（圖6F）。此外，低親和力Q4H7或G4激活的TRM樣TILs中保留TCF1表達的較少，這表明TRM_stem形成有缺陷（圖6G），相比之下，TRM_eff的比例較高（圖6H）。除了致敏性能，抗原在腫瘤上的持久性刺激也是TRM_stem免疫組庫形成所必需的。因此，盡管體外活化的OT-I T細胞在OVA^-腫瘤中（圖6I），在沒有同源抗原刺激的情況下，TRM_stem/ TRM_eff比值顯著降低（圖6J）。綜上所述,這些研究結果表明,T細胞致敏性能和持久性腫瘤抗原的刺激是TRM_stem具備干細胞特性和組織駐留的混合特性免疫組庫形成所必需的,并逐步分化成一系列TRM樣T細胞,通過主動識別腫瘤抗原,逐步達到耗竭狀態。

四、總結

該研究結果為卵巢癌的免疫生物學提供了多方面的見解，為改善免疫治療提供了新的機會，而免疫治療對大多數卵巢癌患者無效的原因有很多，例如阻礙T細胞激活，腫瘤的代謝限制，免疫抑制性髓樣細胞的積累。首先，該研究證明T細胞的免疫原性，即可以特異性識別腫瘤。因此，可使用特異性TILs擴增或用特定TCR轉導的T細胞的個性化治療卵巢癌。其次，該研究發現TRM樣CD8⁺ TILs及循環CD8⁺ TILs在表型和抗原識別方面非常不同。第三，確定關鍵的TRM_stem細胞是一種中間細胞類型，同時具有干細胞樣和組織駐留特征。有趣的是，在以往的研究中，免疫檢查點阻斷治療的有效性被歸因于與TRM樣CD8⁺ TILs不同的干細胞樣CD8⁺ TILs亞群的增殖，而也研究發現它依賴于TRM樣CD8⁺ TILs。另一個重要方面是，TRM樣分化使腫瘤反應性T細胞能夠在瘤床上執行更強的抗腫瘤效應。總之，該研究結果證明一小部分循環CD8⁺ TILs經歷TRM樣分化，轉化為TRM_stem TILs，具有產生新TRM樣TILs和執行抗腫瘤效應的能力，而另一些細胞在反復暴露于抗原后會直接進入耗竭狀態。