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今天給大家介紹一篇發(fā)在（《J Immunother Cancer》IF:12+, 中科院一區(qū)）雜志上的，關(guān)于“單細(xì)胞聯(lián)合Bulk分析揭示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在TME中的功能與機(jī)制”的文章，題目是“M1 hot tumor-associated macrophages boost tissue-resident memory T cells infiltration and survival in human lung cancer.”
背景介紹
腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的作用在確定適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的抗腫瘤效果與腫瘤的抗免疫策略之間的結(jié)果目前依然是有爭(zhēng)議的。巨噬細(xì)胞通過(guò)整合腫瘤微環(huán)境（TME）中的信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)其活動(dòng)和表型。根據(jù)巨噬細(xì)胞被激活的方式，可以分為M1-like（抗腫瘤特性），或M2-like（促癌特性）。在許多實(shí)體腫瘤中，M2-like巨噬細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)與較差的預(yù)后相關(guān)，但在某些腫瘤類(lèi)型中，強(qiáng)的M1-like分布與較好的預(yù)后相關(guān)。本研究的目的是研究這些腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在人群中的相互關(guān)系，以確定他們?nèi)绾握{(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在早期肺癌中的有效性。
概述
在這篇文章中，作者基于手術(shù)切除的肺癌組織，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和bulk測(cè)序結(jié)合的方式刻畫(huà)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和癌旁組織的非腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（NTAMs）的特征。免疫組化將TAM轉(zhuǎn)錄組signature的分布與腫瘤中CD8+組織常駐記憶T細(xì)胞（TRM）的密度關(guān)聯(lián)起來(lái)，并在393例肺癌患者的獨(dú)立隊(duì)列的生存數(shù)據(jù)中進(jìn)行驗(yàn)證分析。作者發(fā)現(xiàn)TAMs和NTAMs的細(xì)胞具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄組譜，并且TAMs展示出了很強(qiáng)的M2-like signature，這在不同樣本之間均是一致的。然而，由免疫染色細(xì)胞支持的單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示，在25%的M2-like TAMs樣本中還共同表達(dá)了一種很強(qiáng)（或者熱點(diǎn)）的M1-like特征（稱為M1 hot）。作者通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，M1 hot的TAMs與TRM具有很強(qiáng)的相關(guān)性，這些都與患者更好的預(yù)后相關(guān)。此外，作者表明了一種機(jī)制：M1 hot的TAMs通過(guò)CXCL9的表達(dá)招募TRM細(xì)胞，并通過(guò)提供TRM所依賴的更多必需脂肪酸來(lái)維持它們。
正文結(jié)果
結(jié)果1：TAM同時(shí)富集到M2和M1特征
作者在33個(gè)配對(duì)的肺癌樣本和癌旁組織的CD45+CD14+HLA-DR+ 細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組分析（bulk數(shù)據(jù)），分別鑒定出腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，形成TAMs和NTAMs。通過(guò)差異表達(dá)分析，識(shí)別到1038個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（圖一AB）。通過(guò)t-SNE分析，發(fā)現(xiàn)這些差異轉(zhuǎn)錄本能夠很好的將TAMs和NTAMs區(qū)分開(kāi)（圖一C）。基于Ingenuity Pathway Analysis (IPA)工具分別揭示了與M2樣和M1樣巨噬細(xì)胞基因圖譜相關(guān)的促腫瘤和抗腫瘤功能的強(qiáng)烈激活（圖一D）。此外，作者發(fā)現(xiàn)與M2原瘤功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，如血管生成（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)）、金屬蛋白酶活性、纖維化和癌癥轉(zhuǎn)移，在TAMs中表達(dá)水平高于NTAMs（圖一E），這個(gè)結(jié)果在GSEA結(jié)果中得以證實(shí)（圖二）。
（圖一）
（圖二）
此外，作者發(fā)現(xiàn)，與 NTAMs相比，IL-4、IL-10、IL-13和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等M2誘導(dǎo)細(xì)胞因子是TAMs的top上游調(diào)控因子，但令人驚訝的是，典型的M1誘導(dǎo)細(xì)胞因子如IFN-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α也表現(xiàn)出類(lèi)似的現(xiàn)象（圖三）。這些數(shù)據(jù)表明肺癌中的TAMs同時(shí)表達(dá)了與M2基因圖譜（腫瘤原體功能相關(guān)）和M1基因圖譜（促進(jìn)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)）相關(guān)的更高水平的轉(zhuǎn)錄本。
（圖三）
結(jié)果2： M2類(lèi)型TAM中均一而M1類(lèi)型TAM異質(zhì)性的特征分析
接下來(lái)，作者想知道根據(jù)bulk轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，是否可以使用M1-like和M2-like signature基因（稱為hot或cold）的相對(duì)富集對(duì)腫瘤樣本中的TAMs進(jìn)行分層，以確定不同的原瘤或抗腫瘤作用。作者從前人的研究中獲取到122個(gè)已知的M2基因（包括CD209, IL10, WNT5A and MMP12等）和116個(gè)M1基因（包括CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, STAT1 and AIM2等）。分析發(fā)現(xiàn)，M2基因集在TAMs樣本中表現(xiàn)出比較均一性（即比較統(tǒng)一），而M1基因集在TAMs樣本中表現(xiàn)出異質(zhì)性（圖四ABC）。
（圖四）
在這個(gè)結(jié)果基礎(chǔ)上，作者想知道，在含有這些M1 hot 的TAMs腫瘤中，是否與M2 TAMs存在互惠（reciprocal）關(guān)系，從而顯示出較弱的M2信號(hào)。因此，作者挑選M1中異質(zhì)性最強(qiáng)的代表基因之一CXCL9（圖4B），并計(jì)算了CXCL9表達(dá)水平與M2基因(CD209, ADORA3, STAT6, SOCS3, IL10 and IRF4)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其實(shí)是不相關(guān)的（圖4D）。并且在TAMs和NTAMs腫瘤的對(duì)比中，CXCL9與M2 marker基因MMP12的表達(dá)模式也是不一致的（圖4E）。這些結(jié)果表明，所有肺癌腫瘤中的TAMs都顯示了強(qiáng)大且均一的M2基因圖譜。
結(jié)果3： 單細(xì)胞RNA-seq揭示了具有雙M1和M2特征的TAM亞群
接下來(lái)，作者希望確定TAM群體到底是M1或M2表型不同比例細(xì)胞的混合物(這是大多數(shù)之前的文獻(xiàn)所表明的)，還是單個(gè)TAM細(xì)胞可能同時(shí)表達(dá)M1和M2特征。作者對(duì)額外兩名早期肺癌患者的腫瘤和鄰近正常肺組織分離的純化巨噬細(xì)胞群進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq分析（約9000個(gè)細(xì)胞，分成8個(gè)clusters；圖五A）。發(fā)現(xiàn)在NTAMs上調(diào)的因子主要富集到正常組織的Cluster1和Cluster4細(xì)胞中，而在TAMs上調(diào)的因子主要富集到肺癌組織的Cluster2和Cluster3細(xì)胞中（圖五BC）。此外，作者發(fā)現(xiàn)M2-like基因signature在兩個(gè)TAM富集的Cluster（Cluster2和Cluster3）中均上調(diào)，而M1-like的signature只在cluster 3細(xì)胞中上調(diào)（圖五D-F）。并且在bulk水平發(fā)現(xiàn)，富集在cluster 3細(xì)胞中的基因與STAT1（已知的主要調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)對(duì)IFN-γ的反應(yīng)，并參與激活M1相關(guān)基因的表達(dá)）呈現(xiàn)共表達(dá)（圖五G）。這些數(shù)據(jù)證明了M1相關(guān)基因和M2相關(guān)基因可以在同一個(gè)細(xì)胞中表現(xiàn)出很強(qiáng)的共表達(dá)現(xiàn)象。作者又通過(guò)共聚焦顯微鏡（Confocal microscopy）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M1-like和M2-like各自的經(jīng)典marker（CXCL9 and MMP12）在TAMs腫瘤中發(fā)生了共表達(dá)，而在NTAMs腫瘤中卻表現(xiàn)出較低的表達(dá)水平（圖五H）。這些發(fā)現(xiàn)表明存在具有雙M1和M2特征的TAM亞群（即Cluster2和Cluster3），其中一個(gè)亞群（cluster 3）表現(xiàn)出M1和M2雙特征上調(diào)（稱M1 hot），而另外一個(gè)亞群（cluster 2）僅表現(xiàn)出M2特征上調(diào)（稱M1 cold）。
（圖五）
結(jié)果4： M1 hot亞群的TAMs與T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)
為了探索M1 hot亞群的TAMs的抗腫瘤免疫功能，作者選擇M1 marker基因CXCL9將bulk樣本分為3類(lèi)：M1 hot (top 25%)，M1 int (25%-75%)，M1 cold (bottom 25%)（圖六A）。連同NTAMs腫瘤，作者發(fā)現(xiàn)CXCL9, CXCL10 等 M1 marker基因在M1 hot的TAMs（而非M1 cold的TAMs）中要顯著高于NTAMs腫瘤，而CD209, MMP12等M2 marker基因在M1 hot和M1 cold的TAMs中都要顯著高于NTAMs腫瘤（圖六ABC）。接下來(lái)，作者對(duì)M1 hot和M1 cold的TAMs腫瘤進(jìn)行差異表達(dá)分析，共識(shí)別到222個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（圖六D）。IPA pathway分析發(fā)現(xiàn)，M1 hot上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要參與抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)pathway，例如：TH1 T細(xì)胞招募（ 表達(dá)更高的CCL5, CXCL9, CXCL10以及CXCL11）, 抗原呈遞, T細(xì)胞擴(kuò)張, 效應(yīng)T細(xì)胞的毒性與分化（圖六E）。此外，發(fā)現(xiàn)M1 hot腫瘤比M1 cold腫瘤更高的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞密度（圖六F）。GSEA分析發(fā)現(xiàn)，M1 signature基因富集到高CD8+ T細(xì)胞的腫瘤中，而M2 signature基因卻沒(méi)有呈現(xiàn)出與CD8+ T細(xì)胞的相關(guān)性（圖六G）。這些數(shù)據(jù)表明，在行使M2功能時(shí)，M1 hot TAMs可能參與了T細(xì)胞的招募和增殖，因此可以塑造抗腫瘤反應(yīng)的質(zhì)量或規(guī)模。
（圖六）
結(jié)果5： M1 hot亞群的TAMs與改善患者生存相關(guān)
在這節(jié)當(dāng)中，作者首先通過(guò)免疫染色的方式確定基于CXCL9表達(dá)水平分組 M1 hot TAMs的方式是靠譜的（圖七A），比如說(shuō)免疫組化M1 hot的患者具有與更高水平的CXCL9表達(dá)和CD8+ T細(xì)胞密度（圖七BC）。已知CXCL9是表達(dá)CXCR3的T細(xì)胞的一種已知的趨化劑，作者通過(guò)比較分析也發(fā)現(xiàn)其正向相關(guān)性，共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者在T細(xì)胞膜上共定位（圖七DE）。接下來(lái)，作者在一套獨(dú)立驗(yàn)證集（n=393, 南安普頓大學(xué)醫(yī)院搜集，基于CXCL9免疫組化分組）和TCGA 肺腺癌（n=495,基于CXCL9 RNA-seq分組）進(jìn)行生存分析，均發(fā)現(xiàn)M1 hot與更好的生存相關(guān)（即高表達(dá)或高豐都的CXCL9與更患者更好的預(yù)后相關(guān)）（圖七FG）。進(jìn)一步，作者在TCGA肺腺癌中發(fā)現(xiàn)，CXCL9表達(dá)與CXCR3表達(dá)呈現(xiàn)很強(qiáng)的正向相關(guān)性，并且CXCR3也與更患者更好的預(yù)后相關(guān)（圖七HI），這證實(shí)了上述的發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明 M1 hot 狀態(tài)通過(guò)招募更好的抗腫瘤TIL反應(yīng)進(jìn)而表現(xiàn)出與患者更長(zhǎng)生存的相關(guān)性。
（圖七）
結(jié)果6： M1 hot亞群的TAMs通過(guò)攝取脂肪酸來(lái)維持TRM細(xì)胞
在這套搜集來(lái)的隊(duì)列中（n=393），作者分別通過(guò)CXCL9（M1 marker）和CD103（TRM marker）免疫組化狀態(tài)將患者分組，分別是M1 (M1 hot、M1 int、M1 cold)和TRM (TRM high、TRM int、TRM cold)。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)TRM high的患者更傾向于屬于M1 hot類(lèi)，并且TRM low的患者更傾向于是M1 cold類(lèi)（圖八A）。此外，作者通過(guò)比較M1 hot和M1 cold分組中腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本（與TRM相關(guān)的基因）表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本也在M1 hot患者中高表達(dá)（圖八B）。并且連同TRM signature基因、細(xì)胞周期以及細(xì)胞毒性/細(xì)因子signature基因均更傾向于富集到M1 hot上調(diào)基因集中（圖八C）。這些結(jié)果表明M1 hot是與TRM相關(guān)的。
（圖八）
接下來(lái)，作者評(píng)估了M1 hot TAMs如何影響或調(diào)節(jié)TRM在腫瘤微環(huán)境中的反應(yīng)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，M1 hot TAMs呈現(xiàn)出更低的脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP3, FABP4 and FABP5）的表達(dá)水平（圖八D）。眾所周知，為了在組織中生存，TRM細(xì)胞依賴于通過(guò)FABP4/5攝取必需營(yíng)養(yǎng)脂肪酸。并且研究表明，IL-4 （M1 cold因子）處理的巨噬細(xì)胞會(huì)增加其脂肪酸攝取。因此，作者假設(shè)M1 cold的TAMs會(huì)比M1 hot的TAMs在腫瘤微環(huán)境中更有效地競(jìng)爭(zhēng)脂肪酸（由于高表達(dá)FABP3, FABP4 and FABP5），并因此在這一必需營(yíng)養(yǎng)素的競(jìng)爭(zhēng)中勝過(guò)TRM細(xì)胞，從而損害了腫瘤中TRM細(xì)胞的長(zhǎng)期維持。
為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者用IFN-γ/LPS和IL-4處理血源性巨噬細(xì)胞(BDMs)，以分別模擬M1 hot和M1 cold TAMs。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，與M1 cold-like的BDMs (IL-4)相比，M1 hot-like的BDMs (IFN-γ和LPS)顯示出脂肪酸攝取減少（圖八E）。這個(gè)現(xiàn)象在通過(guò)siRNA敲除脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP3, FABP4 and FABP5）的實(shí)驗(yàn)中也得以呈現(xiàn)。此外，通過(guò)血液中提取的M1 hot-like的BDMs、M1 cold-like的BDMs分別與CD8+CD103+ T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)CD8+CD103+ T細(xì)胞與M1 hot-like的BDMs與共培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的脂肪酸攝取（圖八F），而其他的T細(xì)胞卻并未呈現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，M1 cold TAM可能通過(guò)細(xì)胞間對(duì)脂質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制減少腫瘤中TRM細(xì)胞的生存和維持。
結(jié)語(yǔ)
這篇文章是比較典型的單細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)合bulk數(shù)據(jù)，生物信息分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)的分析。本文最大的亮點(diǎn)是識(shí)別了一個(gè)具有M1和M2雙特征的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的亞群，并將其與患者生存、T細(xì)胞擴(kuò)張、特別是組織駐留記憶T細(xì)胞的生長(zhǎng)維持直接掛鉤。很好的揭示了它們之間的內(nèi)在聯(lián)系和分子機(jī)理，邏輯也比較清晰，為肺癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響提供新的視角。
參考文獻(xiàn)：
M1 hot tumor-associated macrophages boost tissue-resident memory T cells infiltration and survival in human lung cancer. J Immunother Cancer. 2020
