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大家好，今天給大家分享的文獻(xiàn)是2022年4月份發(fā)表在Cell Genomics上的文章。識(shí)別由疾病相關(guān)變異引起的細(xì)胞功能失調(diào)，可能意味著在細(xì)胞治療中發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)或調(diào)節(jié)新途徑。本研究是第一次深入研究免疫疾病變異對(duì)Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)和功能失調(diào)的影響。
Immune disease variants modulate gene expression in regulatory CD4+ T cells
在調(diào)節(jié)性CD4+ T細(xì)胞中免疫疾病變異調(diào)節(jié)基因表達(dá)
背景：通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWASs）繪制的數(shù)千種疾病變異為疾病生物學(xué)提供了遺傳錨，但對(duì)GWAS信號(hào)的功能解釋一直具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榻^大多數(shù)變異是非編碼的。一種將遺傳變異與下游效應(yīng)聯(lián)系起來的方法包括表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（expression quantitative trait locus，eQTL）作圖，其轉(zhuǎn)錄水平與遺傳多態(tài)性相關(guān)。然而，由于遺傳變異之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），已鑒定的eQTL通常導(dǎo)致數(shù)十到數(shù)百個(gè)相關(guān)變異與基因表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)，因此無法確定致病調(diào)節(jié)變異。
通過使用染色質(zhì)可及性或組蛋白修飾（chromatin QTLs，chromQTLs）對(duì)染色質(zhì)活性進(jìn)行QTL作圖，可以進(jìn)一步推斷出基因表達(dá)變化背后確切調(diào)控變異的優(yōu)先級(jí)。在這種方法中，調(diào)節(jié)染色質(zhì)標(biāo)記活性的變異與chromQTL物理重疊。eQTLs和chromQTLs的組合提供了一個(gè)強(qiáng)大工具包，用于將非編碼變異與表達(dá)基因聯(lián)系起來，用于確定功能變異的優(yōu)先級(jí)，并用于確定調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。最后，疾病GWAS信號(hào)與eQTLs的共定位可以指向疾病關(guān)聯(lián)的致病基因和機(jī)制，因此可將疾病相關(guān)變異與失調(diào)途徑和新藥物靶點(diǎn)聯(lián)系起來。
與常見免疫介導(dǎo)疾病相關(guān)的GWAS變異，如炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA），均富含活性染色質(zhì)標(biāo)記，這些可以標(biāo)記CD4+ T（尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg細(xì)胞））中的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子。免疫表型研究表明，循環(huán)Treg細(xì)胞數(shù)量異常和Treg細(xì)胞抑制功能缺陷均導(dǎo)致免疫疾病患者以及器官和造血干細(xì)胞移植受者的免疫反應(yīng)。總之，Treg細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)的遺傳錨和指向這種細(xì)胞類型功能受損的免疫表型研究表明，確定遺傳變異調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞功能的機(jī)制可能具有重要的臨床意義。盡管Treg細(xì)胞在維持免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但它們?cè)谘h(huán)血液中的低頻率導(dǎo)致可用基因組資源數(shù)量有限。因此，免疫疾病變異通常根據(jù)來自外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）、免疫細(xì)胞或分離出的主要免疫細(xì)胞群數(shù)據(jù)來解釋基因表達(dá)。但這些數(shù)據(jù)集可以稀釋或忽略僅存在于稀有細(xì)胞類型中的基因調(diào)控作用，因此可能會(huì)錯(cuò)過對(duì)疾病有意義的生物效應(yīng)。
在這里，為了能在與疾病生物學(xué)密切相關(guān)的細(xì)胞類型背景下解釋免疫疾病變異，作者生成了第一張從124名健康個(gè)體中分離出的Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控圖譜。作者確定了10880個(gè)QTLs效應(yīng)（3685個(gè)eQTLs和7195個(gè)chromQTLs）。與初始CD4 T細(xì)胞和單核細(xì)胞相比，作者在Treg細(xì)胞中檢測(cè)到21%的eQTLs和29%的活性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子QTLs。通過將Treg QTLs與14種不同免疫疾病相關(guān)變異共定位，作者在Treg細(xì)胞中鑒定了133個(gè)功能相關(guān)的GWAS基因座。免疫疾病GWAS信號(hào)與chromQTLs的重疊改善了68個(gè)免疫疾病位點(diǎn)上的相關(guān)變異。作者將Treg細(xì)胞eQTLs基因分配到81個(gè)免疫疾病位點(diǎn)。在52個(gè)位點(diǎn)中檢測(cè)到無法與下游基因靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的chromQTLs共定位，表明基因調(diào)控效應(yīng)可以在特定細(xì)胞狀態(tài)下表現(xiàn)出來。最后，作者使用優(yōu)先級(jí)基因確定用于重新使用的藥物并定義驗(yàn)證的新靶標(biāo)。作者的研究提供了從免疫疾病相關(guān)變異，通過基因表達(dá)調(diào)控Treg細(xì)胞，到新的治療方案的轉(zhuǎn)化途徑。
方法：
RNA-seq、轉(zhuǎn)座酶可接近性染色質(zhì)測(cè)序（assay for transposase-accessible chromatin using
Sequencing，ATAC-seq）、H3K4me3和H3K27ac ChM-seq（ChIPmentation-seq）、
結(jié)果：
1.Treg細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控的全面目錄
為了鑒定健康人分離的Treg細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控的遺傳變異，作者使用RNA-seq分析了轉(zhuǎn)錄組（124人）、ATAC-seq分析了染色質(zhì)可及性（73人）、用H3K4me3分析啟動(dòng)子（88人）和用H3K27ac分析活性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域（91人）（圖1A）。作者檢測(cè)到12517個(gè)基因表達(dá)，而染色質(zhì)分析顯示39134個(gè)可及性區(qū)域、39409個(gè)H3K4me3標(biāo)記的啟動(dòng)子區(qū)域和33910個(gè)H3K27ac標(biāo)記的活性染色質(zhì)區(qū)域（圖1B）。用62個(gè)樣本，作者估計(jì)了由遺傳成分和染色質(zhì)調(diào)控特征解釋的基因表達(dá)變異百分比。作者觀察到驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄變異的主要成分是普通的遺傳變異。對(duì)于75%的eQTL基因，作者能解釋5%或更多的表達(dá)變異（圖1C）。接下來作者進(jìn)行了QTL作圖以定義Treg細(xì)胞中受遺傳控制的基因和染色質(zhì)特征。作者檢測(cè)到3685個(gè)基因（29%）和125650個(gè)eQTL變異至少有一個(gè)獨(dú)立關(guān)聯(lián)（圖1B-1D）。作者使用染色質(zhì)可及性（caQTL，1450；4%）、H3K4me3（promQTL，1455；4%）和H3K27ac（actQTL，4290；13%）組蛋白標(biāo)記，共繪制了7195個(gè)chromQTLs，對(duì)應(yīng)于9292個(gè)非重疊峰值區(qū)，與152648個(gè)chromQTL變異相關(guān)。在H3K27ac特征中檢測(cè)到大多數(shù)chromQTLs（4290個(gè)actQTL；圖1B）。在所有分析中，基因變異（5761739）、439582（7%）處于峰值內(nèi)；然而，只有一小部分映射到染色質(zhì)特征中，并且還與chromQTLs（38507個(gè)SNPs；0.7%）、eQTLs（22217個(gè)SNPs；0.4%）或兩者（17815個(gè)SNPs；0.3%）相關(guān)聯(lián)（圖1D）。對(duì)于28%（1035）的所有eQTLs基因，作者觀察到至少一個(gè)eQTL變異是chromQTL，并且也位于染色質(zhì)峰中（圖1E），對(duì)于另外2020個(gè)eQTLs基因，作者能夠?qū)⒁粋€(gè)eQTL變異與染色質(zhì)峰聯(lián)系起來，雖沒有檢測(cè)到染色質(zhì)特征上的QTL效應(yīng)。這種重疊的一部分可能沒有功能，因?yàn)槿旧|(zhì)調(diào)控特征在整個(gè)基因組中都很豐富，因此偶然可能會(huì)重疊常見的遺傳變異。有趣的是，作者無法將大多數(shù)actQTL變異與eQTL聯(lián)系起來（圖1E），這意味著這些調(diào)控區(qū)域可能在特定的細(xì)胞環(huán)境下或通過多個(gè)調(diào)控元件的相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
圖1 Treg細(xì)胞QTLs定位概述。（A）研究設(shè)計(jì)示意圖。（B）每個(gè)方法中每次基因組試驗(yàn)定義的特征數(shù)和顯著QTLs數(shù)。（C）由遺傳變異和染色質(zhì)標(biāo)記解釋的eQTL基因表達(dá)變異比例。（D）基因變異的功能分類。（E）eQTL基因分類（上）和actQTL峰分類（下）。
2.定義Treg細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控
在確認(rèn)了數(shù)據(jù)集捕獲了與Treg細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的效應(yīng)后，作者接下來使用了BLUEPRINT項(xiàng)目中的CD4初始T細(xì)胞，因?yàn)樗卜治隽宿D(zhuǎn)錄組和H3K27ac且研究對(duì)象類似。作者觀察到69%的eQTLs與初始CD4 T細(xì)胞共用（圖2A），且具有相似的效應(yīng)大小和相同效應(yīng)方向。在Treg細(xì)胞和初始T細(xì)胞之間觀察到eQTL效應(yīng)的相關(guān)性高于Treg細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的相關(guān)性，這也由pi1估計(jì)值證實(shí)（圖2B和2C）。盡管Treg細(xì)胞和其他兩個(gè)細(xì)胞類型之間的有大量eQTL共享，作者將775個(gè)基因分類為Treg細(xì)胞數(shù)據(jù)集特有的，其中包括92個(gè)在Treg細(xì)胞中表達(dá)的基因。在Treg細(xì)胞特異性eQTL中，有許多對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要的基因，包括TNFRSF14，一種將淋巴細(xì)胞吸引到上皮細(xì)胞的趨化因子（圖2D）。作者比較Treg、初始T細(xì)胞和單核細(xì)胞中相同峰值區(qū)域的遺傳效應(yīng)，觀察到1307個(gè)（29%）actQTLs是Treg細(xì)胞特異性的（圖2A）。盡管所有峰效應(yīng)大小的一致性很小，但具有共享QTLs的峰表達(dá)了相似效應(yīng)大小（圖2B）。pi1分析的結(jié)果也反映了作者從RNA中觀察到的Treg細(xì)胞QTLs在原始數(shù)據(jù)集中的復(fù)制率高于單核細(xì)胞（圖2C）。在Treg細(xì)胞特異性actQTL效應(yīng)中，作者觀察到FCRL3基因啟動(dòng)子的一個(gè)峰值是Treg細(xì)胞抑制功能的潛在負(fù)調(diào)節(jié)因子（圖2E）。
圖2 在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+初始細(xì)胞和單核細(xì)胞中鑒定的eQTLs和actQTLs比較。（A）Treg細(xì)胞的eQTLs和actQTLs與初始T細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例比較。（B）三種細(xì)胞類型之間eQTLs和actQTLs的成對(duì)pi1得分。（C）所有eQTLs和actQTLs的相同基因或峰的回歸斜率和變異對(duì)之間的Spearman相關(guān)性（彩色），以及和共享對(duì)之間的Spearman相關(guān)性（灰色）。（D和E）Treg細(xì)胞特異性（D）eQTL和（E）actQTL的例子。
3.Treg細(xì)胞QTLs與免疫疾病位點(diǎn)共定位
為了將疾病相關(guān)位點(diǎn)精細(xì)定位到致病基因和變異中，作者接下來將Treg細(xì)胞QTL結(jié)果與來自常見免疫疾病的GWAS信號(hào)相結(jié)合，應(yīng)用貝葉斯框架來測(cè)試疾病相關(guān)變異和Treg細(xì)胞QTL信號(hào)共定位。作者測(cè)試了14種免疫疾病相關(guān)的1290個(gè)獨(dú)特的GWAS基因座：過敏性疾病（allergic diseases，ALL）、強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）、哮喘（asthma，AST）、乳糜瀉（celiac disease，CEL）、克羅恩病（Crohn’s disease，CD）、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、銀屑病（psoriasis，PS）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（psoriasis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）、潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和白癜風(fēng)（vitiligo，VIT）。共定位數(shù)量最多的疾病（超過20個(gè)共定位信號(hào)）包括IBD、UC、CD、ALL、T1D、VIT和PBC（圖3A）。作者觀察到疾病基因座和至少一個(gè)Treg細(xì)胞QTL之間有360個(gè)明顯共定位，對(duì)應(yīng)133個(gè)獨(dú)特GWAS基因座（圖3B）。將共定位基因座分為三類：第1層基因座包含GWAS關(guān)聯(lián)與eQTL和染色質(zhì)QTL共定位的31個(gè)信號(hào)。第2層基因座包含50個(gè)信號(hào)，只觀察到eQTL共定位。第3層中52個(gè)位點(diǎn)包括與染色質(zhì)QTL共定位的GWAS信號(hào)，但不包括eQTL，第3層位點(diǎn)代表了大多數(shù)共定位。接下來，作者評(píng)估了那些已識(shí)別的eQTL與特異性調(diào)控Treg細(xì)胞基因表達(dá)的免疫疾病變異體共定位，，而不是初始T細(xì)胞或單核細(xì)胞。在81個(gè)與Treg細(xì)胞eQTL共定位的GWAS位點(diǎn)中，31個(gè)為Treg細(xì)胞特異性位點(diǎn)，且它們不存在于初始T細(xì)胞或單核細(xì)胞中（圖3C）。
圖3 免疫疾病GWAS位點(diǎn)與Treg細(xì)胞QTLs的共定位。（A）Treg細(xì)胞eQTLs和染色質(zhì)QTLs與不同免疫疾病GWAS位點(diǎn)共定位的分布。（B）GWAS位點(diǎn)與不同類型Treg細(xì)胞QTLs共定位的分布。（C）與單核細(xì)胞、初始T細(xì)胞、Treg細(xì)胞eQTLs和actQTLs共定位的免疫GWAS位點(diǎn)數(shù)量。
4.共定位Treg細(xì)胞QTLs優(yōu)先考慮免疫疾病的致病變異和基因
使用與染色質(zhì)QTL峰重疊的第1層和第3層基因座，作者將68個(gè)GWAS基因座的信號(hào)從中位數(shù)48個(gè)相關(guān)變異細(xì)化為每個(gè)位點(diǎn)6個(gè)功能變異基因座（圖4A）。在68個(gè)基因座中，BACH2、CD28、CENPW、HERC2、JAZF1、MAP3K8、PIM3、RERE、STAT5A和THBS3基因座與eQTLs共定位并被精煉為單一功能變異（圖4B）。Treg細(xì)胞專有共定位以及Treg細(xì)胞actQTL特異性共定位表明Treg細(xì)胞生物學(xué)特征的通路調(diào)控。因此，作者更詳細(xì)地研究了帶IBD GWAS信號(hào)的Treg細(xì)胞專有共定位，由chr10:30,401,447（rs10826797）變異標(biāo)記，該變異與actQTL共定位，在MAP3K8的TSS處調(diào)節(jié)一個(gè)6 kb大的H3K27ac峰和一個(gè)MAP3K8基因的eQTL（圖4C）。此外，作者觀察到與過敏相關(guān)的基因座與STAT5A eQTL以及80 kb actQTL共定位。該峰與STAT5A TSS重疊。近一半過敏變異LD與受調(diào)控的actQTL峰重疊，其中一個(gè)變異chr17:42,266,938（rs34129849）也映射到STAT5B基因內(nèi)含子處629-bp開放染色質(zhì)區(qū)（chr17: 42,266,595– 42,267,224）（圖4D）。
圖4 與Treg細(xì)胞QTLs共定位的免疫疾病關(guān)聯(lián)功能細(xì)化。（A）在x軸上LD中的SNPs數(shù)量，映射到y(tǒng)軸的chromQTL的SNPs數(shù)量達(dá)到峰值。（B）在LD中映射到chromQTL內(nèi)部的SNPs數(shù)量在x軸上達(dá)到峰值，同時(shí)映射到y(tǒng)軸的chromQTL和ATAC的SNP數(shù)量也達(dá)到峰值。（C和D）從上到下顯示基因注釋軌跡；ATAC-seq、H3K27ac和H3K4me3 ChM-seq的染色質(zhì)景觀；疾病區(qū)域關(guān)聯(lián)圖；eQTL和actQTL關(guān)聯(lián)p值，主要集中在被純合子基因型分層的H3K27ac圖譜中；被eQTL和actQTL分層的基因型小提琴圖。（C）顯示了與MAP3K8 eQTL和由chr10:30,401,447（rs10826797）標(biāo)記的IBD共定位基因座。（D）顯示了由chr17:42,262,844（rs7207591）標(biāo)記的與STAT5A eQTL和chr17:42,219,755 42,299,818 actQTL共定位的過敏相關(guān)的基因座。
5.Treg細(xì)胞QTLs闡明了CD28共刺激、腫瘤壞死因子和IL-10信號(hào)通路的藥物靶向作用
盡管GWAS在繪制疾病風(fēng)險(xiǎn)變異方面取得了成功，但將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為藥物靶點(diǎn)一直具有挑戰(zhàn)性。因此，作者使用Open Targets Platform系統(tǒng)地評(píng)估與免疫疾病信號(hào)共定位的eQTLs是否能夠識(shí)別已知和潛在的新藥靶點(diǎn)。在與免疫疾病共定位并在Open Targets Platform測(cè)試的91個(gè)eQTL基因中，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)（第1層：BLK、CD28、PIM3、PTGIR和TNFRSF9，第2層：ERAP2、NDUFS1、TNFRSF1A和TYK2；圖5A）已成為已知藥物的靶標(biāo)并用于臨床或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。其中7個(gè)eQTL基因可以考慮用于藥物再利用：ERAP2、NDUFS1、PIM3、PTGIR、TNFRSF1A、TNFRSF9和TYK2，其中三個(gè)是Treg細(xì)胞特異性eQTLs。作者還觀察到63個(gè)基因尚不屬于臨床治療的一部分，但具有藥物治療的證據(jù)，其中47個(gè)被歸為高成藥性（其中8個(gè)是Treg細(xì)胞特異性的；圖5A）。作者使用Open Target定義成藥性，它基于蛋白質(zhì)中可用于小分子結(jié)合位點(diǎn)的可用性，抗體治療中可接近的抗原表位的存在，或一種化合物在臨床試驗(yàn)中具有不同于小分子或抗體形態(tài)的報(bào)告。作者觀察到具有易處理特點(diǎn)的基因分為三個(gè)途徑：CD28家族共刺激、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)傳導(dǎo)和IL-10信號(hào)傳導(dǎo)（圖5B）。這些途徑在Treg細(xì)胞活化、增殖和存活以及抑制效應(yīng)T細(xì)胞中起重要作用。
圖5 免疫疾病與Treg細(xì)胞QTLs的共定位決定藥物靶點(diǎn)。（A）1層和2層位點(diǎn)與免疫疾病具有藥物易處理性的GWAS變異共定位。（B）在CD28共刺激、TNF和抗炎IL-10通路中，具有易處理潛力的1層和2層基因。
結(jié)論：
1.文章構(gòu)建了來自124人的CD4+ Treg細(xì)胞中基因表達(dá)和染色質(zhì)活性的數(shù)據(jù)集。
2.構(gòu)建了3685個(gè)基因和7195個(gè)染色質(zhì)區(qū)數(shù)量性狀位點(diǎn)QTL圖譜。
3.Treg細(xì)胞QTLs和免疫疾病GWAS變異的共定位可以發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：Bossini-Castillo L, Glinos D A, Kunowska N, et al. Immune disease variants modulate gene expression in regulatory CD4+ T cells[J]. Cell Genomics. 2022,2(4):100117.
