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研究背景
緊抓熱點，是成就高分文章的必要條件。當前最熱的莫過于銅死亡了，銅是人體必須的微量元素，參與多種生物過程。但銅的濃度超過一定的值時，就使機體細胞致死，導致銅死亡。研究表明與銅死亡相關的基因有10個，其中Ferredoxin 1（FDX1）是重要的正向調控因子（1）。
銅的水平與肝硬化、急性肝炎（2）肝癌相關，血清銅或許可作為肝癌檢測的標志物（3）。在肝細胞癌（HCC）患者中，銅的濃度過高會導致腫瘤產生、化療耐藥和不良的預后反應。以上研究都表明銅可能與肝臟惡行腫瘤的發生相關，為肝臟腫瘤的療法提供新的視角。
下面小編與大家分享一篇具體探究銅死亡在肝癌中的應用，文章首先探究銅死亡相關基因FDX1在肝細胞癌患者中以及不同疾病進展周期中的表達情況，其次利用銅死亡相關風險評分（CRRS）將肝細胞癌患者進行分組，從而探究不同分組在突變、臨床特征和腫瘤治療中的表現。文章7.11日發表于frontiers in immunology雜志（IF：8.786）。
研究結果
1、Ferredoxin 1（FDX1）在肝細胞癌（HCC）患者表達情況分析
FDX1在銅死亡中具有關鍵調控作用，敲除此基因會引起抗銅誘導細胞死亡（4）。為了探究銅死亡在HCC患者中的狀態，文章分析了FDX1的表達情況。與正常組織相比，HCC患者FDX1的表達顯著下調。并隨著疾病的進展，FDX1表達量顯著下降。scRNA測序結果顯示，HCC患者中所有的腫瘤細胞和正常細胞都可以檢測到FDX1，主要檢測到的細胞類型為肝祖細胞（hepatic progenitor cells）和惡性細胞（malignant cells）。文章還將HCC患者分為FDX1高表達組和低表達組，高表達組患者預后效果顯著好于低表達組。
2、CRRS評分系統的構建和驗證
FDX1編碼的還原酶使Cu2+轉化為毒性更強的Cu1+，并調節蛋白質脂酰化，促進脂酰化二氫硫酰胺S-乙酰轉移酶（DLAT）的寡聚形成，并隨后誘導蛋白質毒性應激，這使FDX1在銅死亡中起到關鍵性作用，因此假設FDX1相關特征可能有助于評估這種銅誘導的肝癌細胞死亡的發生。
首先進行相關性分析，從3個數據集中挑選出36個FDX1相關基因。對篩選出的基因進行KEGG和GO分析，發現36個基因均富集在TCA循環相關的分子功能和生物過程中，并與碳代謝、丙酮酸代謝等相關。對FDX1及其相關基因建立LASSO回歸模型，得到4個關鍵基因，分別為catalase (CAT), solute carrier family 27A (SLC27A), enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (EHHADH), 和 aldehyde dehydrogenase 5 family member A1 (ALDH5A1)。進一步對產生的4個關鍵基因進行多變量Cox分析，每個樣本的分數是通過乘以每個關鍵基因的基因表達值和其對應系數，score=- 0.13681 * CAT - 0.07452 * EHHADH - 0.09026 * ALDH5A1 - 0.12120 * SLC27A5。為了便于在不同隊列之間進行比較，使用先前研究中報告的公式計算CRR，CRRS = (score-Min)/absolute(Max)（5）。
使用CRRS評分系統對患者的生存時間進行預測，大約47.3%的肝癌患者被分為銅死亡相關風險評分高（High-CRRS）組，與銅死亡風險評分低（Low-CRRS）組的其余患者相比，這些患者的生存時間明顯縮短，并且在不同數據集中的結果是一致的。
3、CRSS與臨床特征
在HCC患者的臨床特征方面，不同風險組在年齡、性別、纖維化/肝硬化方面均沒有顯著性差異。但在甲胎蛋白（AFP）、TNM分期等臨床癥狀上，High-CRRS的患者明顯表現更差，這也說明了High-CRRS的患者在整體的臨床表現和預后相對于Low-CRRS的患者會更差，為臨床治療提供了非常好的思路。
表1 銅死亡相關風險評分（CRRS）與肝細胞癌（HCC）的臨床病理特征
驗證CRRS是否可以作為OS的獨立預后預測因子。首先將臨床病理特征和CRR輸入單變量Cox回歸分析，結果顯示在GSE14520（[Hazard ratio (HR) = 2.479, 95% CI = 1.469–4.19, p < 0.001）和TCGA(HR = 2.147, 95% CI = 1.099–4.19, p = 0.0253)數據集中CRRS均與OS顯著相關。多變量Cox回歸分析結果中，矯正其他因素后CRRS仍然可以作為獨立預后因子 (p < 0.001 and p = 0.008）。
4、CRRS與代謝特征
GSEA富集結果顯示，Low-CRRS組的富集在代謝相關途徑，如脂肪酸代謝、丙酮酸代謝和檸檬酸循環（TCA循環）。低氧誘導因子-1（HIF-1）通過氧化或糖酵解進行葡萄糖的消耗，持續增加HIF-1a將增強腫瘤細胞中的有氧糖酵解，研究發現High-CRRS組的患者HIF1A也升高。
5、CRRS與免疫特征
TME由多種非腫瘤細胞組成，包括免疫細胞和基質細胞，如內皮細胞和成纖維細胞，影響著癌癥的生長和侵襲。結果顯示在High-CRRS組和Low-CRRS組之間，基質評分方面沒有差異 (p = 0.93）。但在免疫評分方面，High-CRRS組的免疫評分顯著高于Low-CRRS組，表明在High-CRRS組中免疫細胞浸潤更高。High-CRRS組HCC患者在一些抗腫瘤免疫浸潤，如共激活分子、B細胞、檢查點抑制和T細胞顯示出明顯更高的富集度。
在利用CIBERSORT算法進一步評估TCGA-LIHC數據集中免疫細胞的浸潤水平時發現，兩組患者的大多數抗腫瘤免疫細胞浸潤無差異。High-CRRS組患者的M0巨噬細胞（p<0.0001）、調節性T細胞（p<0.001）和濾泡輔助性T細胞（p<0.0001）比例較高。此外，在銅死亡風險評分低（Low-CRRS）組的肝細胞癌（HCC）患者中觀察到較高水平的M2巨噬細胞（p<0.01）、M1巨噬細胞（p<0.0001）、靜息肥大細胞（p<0.0001）和單核細胞（p<0.001）
6、CRRS與腫瘤治療的效果
CRRS評分系統對于用藥方面的指導文章也進行了探索。索拉菲尼是肝細胞癌患者的一線治療用藥，對藥物療效較好的患者CRRS評分較高，并且抗銅死亡相關的基因如FDX1、LIAS和PDHB在反應者中顯著低表達。經導管動脈化療栓塞（TACE）是BCLC A或B的肝細胞癌患者常用的治療的手段，針對TACE治療，治療效果不好的患者CRRS評分高，并且銅死亡誘導關鍵基因FDX1在對治療有反應的患者中顯著高表達。
免疫治療是目前腫瘤治療中非常重要的方面，本文也對免疫檢查點的表達進行了分析。基于CRRS分組標準，PDL1的表達在不同分組中沒有差異。PD1、TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA4在High-CRRS組中顯著高表達，提示這類患者使用免疫檢查點抑制劑效果會更好。
總結
該研究結合單細胞分析了銅死亡基因FDX1在肝細胞癌中的表達情況，并構建了FDX1相關的預后風險評分系統CRRS，總結了其與臨床特征及預后的關系，在肝細胞癌的化療和免疫治療方面有著重要的指導意義，也對CRRS評分系統的應用性進行了驗證。如果擔心普通的銅死亡預后分析思路撞車，那么另辟蹊徑自己設計個性化的思路已然成為趨勢，只要有理有據何愁過不去審稿人那關。
銅死亡個性化生信分析思路
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Koizumi M, et al. A Marked Increase in Free Copper Levels in the Plasma and Liver of LEC Rats: An Animal Model for Wilson Disease and Liver Cancer. Free Radic Res (1998) 28(5):441–50. doi: 10.3109/10715769809066881
3. Zhang YJ, Zhao DH, Huang CX. [The Changes in Copper Contents and its Clinical Significance in Patients With Liver Cirrhosis and Hepatocarcinoma]. Zhonghua Nei Ke Za Zhi (1994) 33(2):113–6.
4. Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, Dreishpoon M, Verma A, Abdusamad M, et al. Copper Induces Cell Death by Targeting Lipoylated TCA Cycle Proteins. Science (2022) 375(6586):1254–61. doi: 10.1126/science.abf0529
5. Qu H, Zhao H, Zhang X, Liu Y, Li F, Sun L, et al. Integrated Analysis of the ETS Family in Melanoma Reveals a Regulatory Role of ETV7 in the Immune Microenvironment. Front Immunol (2020) 11:612784. doi: 10.3389/ fimmu.2020.612784
6. Yang C, Huang X, Liu Z, Qin W, Wang C. Metabolism-Associated Molecular Classification of Hepatocellular Carcinoma. Mol Oncol (2020) 14(4):896–913. doi: 10.1002/1878-0261.12639
