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結直腸癌腹膜轉移的分子特征
導讀
在結直腸癌(CRC)患者中，有很多患者在病程中發生腹膜轉移(PM)。PM與較差的生活質量和臨床結局有關，所以為了改善對這一患者群體的護理，我們需要更好地了解CRC-PM的分子特征。在下文中，作者分析了52名CRC-PM患者的分子特征，證明CRC-PM代表了一個不同的CRC分子亞型CMS4，并可以進一步分為三個不同的類別，每個類別都有獨特的特征。最后，作者定義了CRC-PM的進化特征，表明多克隆轉移種植是這些病變的基礎。總之，作者的研究結果表明，CRC-PM應被視為一種獨特的疾病實體。
文章解讀
作者在52例結直腸癌患者中，收集了82例新鮮冰凍腹膜轉移標本和8例配對的原發癌標本。作者根據RNA轉錄圖譜(圖1A)，確定了單發(n=37)或多發腹膜病變(n=15)的CMS。雖然觀察到CMS4樣本之間具有轉錄異質性，但大多數腹膜轉移病變被歸類為CMS4 (圖1A)。同一患者的多個樣本之間的一致性很高，有13/15的多個樣本的患者在所有病變中顯示相同的分類(圖1B)。作者將82.6%的腹膜轉移患者歸類為CMS4，而CMS1、CMS2、CMS3或混合型CMS的發生率要低得多(圖1B)。與I-IV期原發結直腸癌標本相比，CMS4在CRC-PM組（轉移標本）中高度富集(圖1C)。這些結果表明，CMS4癌癥經常伴有腹膜病變。同時在一組II期CRC原發腫瘤患者中，作者發現CMS4患者的腹膜轉移發生率顯著更高（圖1D，E），佐證了這一觀點。另外，作者對獨立隊列的原發結直腸癌和配對的PM組織進行CMS分類，進一步驗證了這些發現。
對每個患者進行突變分析，作者發現CMS1分類與MSI（microsatellite instable）和BRAF-V600E突變密切相關(圖1B)。其中4例MSI樣本全部是CMS4亞型，并且全部來源于粘液性腫瘤(圖1B)。CMS3患者的特征是Smad4突變，但在該類患者中沒有檢測到其他致癌突變。另外所有CMS2患者中均發現KRAS和TP53突變。作者還發現，在腹膜轉移隊列中，NRAS突變略少，而KRAS突變頻率顯著增加(圖1F)，這高于最近報道的轉移性結直腸癌中KRAS的突變頻率。與上述結果一致，作者也在原發II期腫瘤(AMC-AJCCII-90)中檢測到KRAS/BRAF的突變富集以及KRAS信號活性增加，這些腫瘤最終將復發為腹膜轉移疾病。這些發現表明，KRAS的激活是腹膜擴散的預測因素。總之，在這里作者通過對CMS亞型的分析和突變分析描述了腹膜轉移瘤組織的分子特征。
轉移灶在CMS亞型之間表現出明顯的形態差異，CMS2和CMS3的腺體結構整齊，CMS4樣本的間質細胞增多，腫瘤細胞含量減少。雖然大多數腹膜病變位于覆蓋腸道的腹膜或大網膜，但CMS2分類的腹膜病變主要來自卵巢，這表明CMS亞型在播種過程中具有特異性。與TCGA數據庫中原發性結腸癌(COAD)隊列相比，腹膜轉移隊列中的粘液性原發腫瘤顯著富集。以前人們認為粘液腺癌類型以前與CMS4、MSI、RAS-MAPK通路突變、總體預后較差和腹膜轉移頻率增加有關。雖然在作者的腹膜轉移隊列中，粘液腺癌與MSI和RAS突變無關，但它與腹膜癌指數（PCI）相關。PCI評分與總生存率(OS)(圖1G)和復發死亡率(RFS)密切相關。相比之下，轉移性或同時性腹膜轉移（在結直腸癌確診時即發現的腹膜轉移）患者之間的OS和RFS沒有發現差異。RAS或BRAF突變不影響OS，然而，作者確實發現有少數RAS/BRAF野生型癌癥患者表現出更差的RFS和顯著增加的腫瘤負荷。由于非CMS4患者數量較少，作者沒有發現PCI評分與CMS分型之間有統計學意義，但大多數患者的PCI評分較高，被歸類為CMS4(圖1H)。相應地，與CMS2、CMS3或混合CMS患者相比，CMS4患者表現出更差的OS(圖1I)。
在本文中，能形成腹膜轉移能力的細胞系被稱為CMS4細胞系(圖2A，B)。為了確定腹膜轉移的決定因素，作者進行了差異基因表達分析，比較了在體內能和不能形成腹膜轉移的CRC細胞系 (圖2C) 。這項分析表明，MSN(膜組織延伸刺突蛋白)在形成和不形成腹膜轉移的細胞系中表達差異最大(圖2C)。MSN在腹膜轉移患者的原發腫瘤(圖2D)和CMS4原發CRCs (圖2E)中的表達顯著升高，這表明MSN在腹膜病變中的表達不增加，但在腹膜轉移起源的原發癌中已經存在。患者腹膜轉移組織的染色證實了大量MSN陽性的腫瘤細胞(圖2F)。此外，與肝轉移相比，MSN在腹膜轉移中的表達也顯著增加(圖2G)。MSN蛋白在體內腹膜腫瘤的腫瘤邊界表達最豐富，特別是在腫瘤細胞與周圍組織相互作用的地方(圖2H) 。在功能上，MSN參與了細胞與細胞外基質成分的黏附，因為MSN的敲除減少了播種后絲狀足的形成和對膠原蛋白表面的黏附，并減少了3D生長(圖2I-N) 。相反，MSN在CMS2細胞系中的異位表達導致了體外絲狀足的形成，這再次強調了MSN在細胞附著中的作用。另外，MSN基因敲除導致體內腹膜轉移減少(圖2O-R)，而這不影響體外生長或體內皮下腫瘤生長速度。總之，這些數據表明在腹膜轉移過程中需要CMS4相關MSN的表達。
腹膜轉移的患者在進展率和癥狀上都表現出顯著的臨床差異。考慮到CMS4樣本的轉錄譜中存在廣泛異質性(圖1A)，作者猜測可能存在多個CMS4亞簇。通過進一步的分析，作者發現了3個不同CMS4簇(CMS4-PM.A、B和C)，這三個亞簇具有不同分子和臨床特征 (圖3A)。與CMS4-PM.A相比，作者觀察到CMS4-PM.C亞組更傾向于大網膜作為轉移部位，而腫瘤細胞含量或原發腫瘤位置的沒有顯著差異(圖3A)。突變分析顯示，在CMS4-PM.A簇中KRAS突變顯著富集，在CMS4-PM.B簇中TP53突變的頻率相對較高(圖3A，B)。在CMS4-PM.B簇中觀察到KRAS和TP53的通路活性明顯降低，而在該簇中發現的KRAS突變出現的頻率較低，這表明在CMS4-PM.B簇中存在一種不同的、較少依賴KRAS的生物學機制(圖3B，C)。進一步的基因集富集分析表明，在CMS4-PM.A(RAS突變亞型)中，氧化磷酸化、Myc和活性氧 (ROS)途徑高表達。而CMS4-PM.B（粘液型）在DNA復制過程和E2F靶點上顯著富集，KRAS和TP53信號評分比較低，并且具有粘液細胞類型特征(圖3D)。CMS4-PM.C的上皮-間充質轉化、轉化生長因子-β、KRAS和免疫相關途徑(炎癥亞型)的表達水平最高(圖3D)。Bulk-RNA測序的反卷積顯示，除CMS1病變外， CMS4-PM.C簇的樣本具有最高的免疫和基質細胞浸潤(圖3E)。免疫細胞的進一步去卷積表明，CMS4亞組之間的免疫細胞群組成也不同，CMS4-PM.B中髓系細胞的相對豐度較少(圖3F)。在CMS4-PM.C(炎癥亞型)樣本中，PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3或TIGIT等免疫檢查點抑制分子的基因表達上調，這表明這些腫瘤中存在免疫抑制微環境(圖3G)。為CRC患者的治療提供了新的研究思路。在臨床上，CMS4-PM.B病變的患者表現出較高的PCI評分(圖3H)，而與其他兩個亞型相比，OS更差 (圖3I)。
結直腸癌細胞種植后，會在腹膜表面發生腹膜轉移。與內臟器官(如肝臟)的轉移不同，腹膜沒有預先存在的基質環境，比如器官內的成纖維細胞、免疫細胞和內皮細胞。。腹膜病變會吸引不同類型的細胞，但目前尚不清楚這種現象與原發性腫瘤部位的間質成分有何關系。為了解釋這一現象，作者將來自同一患者的原發腫瘤和腹膜轉移瘤進行配對研究。轉錄組分析顯示匹配的一對之間具有高度相似性(圖4A)。相反，肝轉移瘤并未與其配對的原發性腫瘤反映出不同的微環境(圖4B)。與原發性腫瘤相比，作者只有在一小部分腹膜轉移樣本中，觀察到了CMS亞型的轉換(圖4C)，而在肝轉移中CMS亞型的轉換更為常見(圖4D)。另外，轉錄組數據的去卷積證實原發性結直腸癌和腹膜轉移瘤的上皮細胞、基質細胞和免疫細胞的組成高度保守(圖4E，F)。接下來，作者對6例冰凍標本進行了單細胞轉錄組分析，其中包括1對配對的原發性結直腸癌和腹膜轉移瘤。對26,570個細胞的聚類分析顯示存在不同的細胞類型(圖4G)。而不同患者的上皮細胞是分開聚類的，免疫和基質細胞類型按細胞類型聚類在一起，與患者來源無關(圖4G)。配對的原發性腫瘤和腹膜轉移瘤的上皮細胞明顯聚集在一起，這表明上皮細胞在患者體內的相似性很高，而在患者間顯示出高度的異質性(圖4H)。總之，在CRCs中，腹膜轉移瘤囊括了原發癌的表型和細胞組成。
拷貝數變異(CNV)分析表明，在TCGA數據庫中，腹膜和肝臟轉移瘤的獲得/丟失頻率分布與CRCs高度相似。然而，通過分析單個CNV圖譜，作者發現腹膜和肝臟轉移瘤樣本之間有一些顯著的差異。首先，與出現肝轉移的患者相比，原發性腫瘤和腹膜轉移瘤的CNV都要低得多(圖4I)。同樣，與肝轉移患者相比，原發性結直腸癌和轉移癌患者的拷貝數異質性(CNH)顯著低且更穩定。直接比較轉移瘤和配對的原發性結直腸癌CNV特征，作者發現與肝轉移瘤相比，腹膜病變與其原發性腫瘤更相似(圖4J)。另外，作者通過對配對的原發癌和腹膜轉移瘤的單細胞CNV分析證實原發癌和腹膜轉移瘤之間具有高度保守的CNV圖譜和克隆異質性(圖4K)。總體而言，這些發現表明，與肝臟相比，腹膜轉移是一個獨特的、CMS4特異性的轉移過程，腹膜轉移瘤保留了原發腫瘤的克隆異質性和轉錄特征(圖4L)。
全文總結
本篇文章對CRC衍生的PM隊列進行分子表征，發現其主要分子亞型是CMS4，并且富含KRAS突變。CMS4亞型進一步能夠細分為具有不同特征的三個亞組。與CMS4相關的結構蛋白Moesin在腹膜播散中起著關鍵作用。此外，作者還定義了CRC-PM的特定進化特征，表明這些病變由多克隆轉移性播種造成。因此，作者認為，CRC-PM應被視為一種獨特的疾病實體。
參考文獻
1. Lenos KJ, Bach S, Ferreira Moreno L, et al. Molecular characterization of colorectal cancer related peritoneal metastatic disease. Nat Commun 2022; 13(1): 4443.
