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大家好，今天給大家分享的是2022年5月發表在Hepatology（IF=17.2）上的文獻。非病毒性肝癌的關注率逐漸升高，其腫瘤免疫異質性及其對聯合免疫治療反應的影響尚未明確。本文通過多組學確定了肝癌瘤內脂肪變性和耗竭腫瘤免疫微環境之間的聯系。
Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma
在肝細胞癌中多組學確定了瘤內脂肪變性和耗竭腫瘤免疫微環境之間的聯系
研究背景：肝癌是全球致死率排名第四的癌癥。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌類型，是一種具有多種病因的異質性疾病。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是HCC的主要原因之一，由于監測和治療不斷改善，全球HCV相關HCC（HCV-HCC）的患病率一直在下降。同時，非病毒性HCC的患病率正在迅速增加，其原因多種多樣，如酗酒、非酒精性脂肪肝（NAFLDA）和糖尿病（DM）。了解HCC的多樣性以開發靶向治療將需要解開致癌過程的分子機制。在過去20年中，已在遺傳和轉錄組水平上對HCC進行了分析。然而，分子和臨床病理學特征之間的關系，特別是在非病毒性HCC患者中，尚未完全確定，除了最近關于NASH-HCC突變特征的一份報告。近年來，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在各種實體腫瘤中顯示出顯著療效。這些藥物包括針對細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）、程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）及其配體PD-L1的單克隆抗體。2020年，IMbrave150試驗表明，與索拉非尼相比，使用阿替利珠單抗聯合貝伐單抗的抗PD-L1聯合抗VEGF療法顯著延長了不可切除HCC患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS），并且聯合免疫療法目前已成為治療HCC的焦點。雖然已成為晚期HCC患者的一線療法，但緩解率約為30%；因此，超過一半的患者不會獲得太多益處。這可能是由于HCC患者分子異常和腫瘤免疫微環境（Tumor Immune Microenvironment，TIME）的高度異質性。一般來說，TIME根據腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）水平和免疫檢查點表達分為免疫排除、免疫激活和免疫耗竭亞型。一項meta分析表明，TILs水平和PD-1/PD-L1表達與多種癌癥類型對ICIs的反應呈正相關。然而，曾有人最近報道，盡管存在高水平的CD8+PD1+T細胞，但由于免疫監測受損，非病毒性HCC，尤其是NASH-HCC對免疫治療的反應可能較弱，提示NASH-HCC存在獨特TIME。然而，非病毒性肝癌的腫瘤免疫異質性及其對聯合免疫治療反應的影響尚未明確。在這項研究中，作者利用基因組和轉錄組對113名非病毒性HCC患者進行了分子和免疫學分析。這種多組學方法能夠根據預后或TIME對非病毒性HCC患者進行分層。作者進一步確定了脂肪變性HCC與免疫富集但免疫耗竭TIME之間的新聯系。從機制上講，作者發現HCC細胞中的脂質積累誘導PD-L1上調并促進共培養的巨噬細胞和成纖維細胞的免疫抑制變化。最后，作者發現通過化學位移MR成像鑒定的脂肪變性HCC患者對使用抗PD-L1和抗VEGF抗體的聯合免疫治療敏感，這表明肝癌中腫瘤內脂肪變性可能是預測免疫治療療效的新型成像生物標志物。
數據：RNA-seq數據已保存在GEO中，登錄號：GSE190967。
基因組序列數據已保存在JGA中，登錄號：JGAS000523和JGAD000642。
空間轉錄組學數據已保存在JGA中，登錄號：JGAS000311。
結果：
1、多組學將非病毒性肝細胞癌分為三個預后亞型
通過腫瘤RNA測序了解非病毒肝細胞癌的分子異常。轉錄組學無監督聚類分析將113例非病毒性HCC患者分為3類（I、II和III類）（圖1A）。I類患者預后最差，而III類患者預后最好（圖1B）。GAGE分析中I類顯示細胞周期和有絲分裂相關基因集隨著FOXM1和AURKB上調而富集，GAGE分析中III類顯示免疫細胞激活相關基因耗竭而wnt-β-catenin信號通路基因GLUL、SPARCL1、AXIN2、GREB1上調，樹突狀細胞向腫瘤細胞遷移相關基因CCL4、CCL5下調。結合之前分子分類研究，I類與Chiang分子分類中的增殖亞型關聯。II類與Chiang分類中的IFN亞型和Hoshida分類中的S1亞型相關聯。第III類與Chiang分類中CTNNB1亞型和Hoshida分類中的S3亞型相關聯（圖1A）。接下來，對55名非病毒性HCC患者進行基因組測序，檢測到69個基因異常，與前期研究一致。在55個樣本中有50個檢測到體細胞突變，并且經常在TERT啟動子區、CTNNB1和TP53中觀察到（圖1C）。綜合分析顯示I類與TP53突變密切相關，III類與CTNNB1突變有關（圖1C）。TP53突變的非病毒性HCC預后最差，而CTNNB1突變的非病毒性HCC預后最好（圖1D）。
圖1 多組學將非病毒性肝細胞癌分為三個預后亞型。（A）非病毒性肝癌的轉錄組分型。（B）按分子分類的患者Kaplan-Meier分析。（C）55例非病毒性肝癌患者的基因組序列分析。（D）非病毒性肝癌患者基因組異常分層的Kaplan-Meier分析。
2、基于TIME的非病毒性HCC分類
接下來，為了根據TIME對非病毒性HCC進行分類，作者對腫瘤轉錄本進行了NTP分析，并確定了已報道的以瘤內免疫浸潤性較強為特征的免疫細胞亞型。CIBERSORT分析發現113種腫瘤中有43種被歸類為免疫亞型，并顯示出更高水平瘤內免疫細胞和CTLs（圖2A，B）。免疫亞型顯示腫瘤內II類顯著富集，CTNNB1突變頻率明顯降低（圖2C，D）。CTNNB1突變的非病毒HCCs腫瘤內免疫細胞浸潤水平顯著降低（圖2E）。
圖2 基于TIME的非病毒性HCC分類。（A）對腫瘤轉錄組NTP分析確定了113個腫瘤中的43個為非病毒性肝癌的免疫亞群。（B）免疫組和其他組之間總免疫細胞和細胞毒性T細胞的CIBERSORT評分比較。（C）免疫組和其他組各分子百分率比較。（D）免疫組與其他組CTNNB1或TP53突變百分率比較。（E）有CTNNB1突變與無CTNNB1突變的HCC之間CIBERSORT評分比較。
3、脂肪性HCC表現為免疫富集但免疫耗竭的免疫微環境
前期發現HCC中脂肪變性與免疫亞型密切相關，事實上脂肪性HCC占非病毒性HCC的23%（圖3A），它包含更高水平的瘤內免疫細胞（圖3B，C）。有趣的是，ssGSEA和通路分析顯示，在脂肪變性HCC中，T細胞耗竭信號和基質信號以及TGF-β激活水平顯著升高（圖3C，D）。脂肪變性HCC還顯示出多種與T細胞耗竭有關的免疫檢查點和轉錄因子以及癌相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）標志物上調（圖3E）。此外，CIBERSORT分析顯示，脂肪變性HCC中有大量M2巨噬細胞浸潤，隨之參與巨噬細胞M2極化和免疫抑制的細胞因子和趨化因子也上調（圖3C，E）。免疫組化分析證實在GPC3+的HCC細胞中PD-L1表達上調，并發現非病毒性肝癌標本中CAFs和M2巨噬細胞大量浸潤（圖3G-J）。總的來說，脂肪性HCC呈現免疫富集但免疫耗竭的TIME，其特征是T細胞耗竭、M2巨噬細胞和CAFs浸潤、PD-L1高表達和TGF-β信號激活。
圖3 （A）脂肪性HCC的代表性圖像。T和NT分別代表腫瘤和非腫瘤。（B）脂肪變性和非脂肪變性HCC樣本的CIBERSORT總免疫細胞評分比較。（C）113例中26例被確定為脂肪性HCC。免疫得分圖顯示免疫相關基因富集得分和CIBERSORT得分熱圖。分子特征圖是顯示脂肪變性HCC中代表性基因相對表達水平熱圖。KEGG通路是顯示脂肪變性HCC中代表性信號通路富集熱圖。（D）脂肪性和非脂肪性HCC樣本間T細胞耗竭特征、基質特征和TGF-β信號通路富集得分比較。（E）Heatmap顯示了抑制性免疫檢查點分子（上）、參與T細胞耗竭的轉錄因子（中）以及CAFs和M2巨噬細胞標志物（下）的代表性基因表達水平。（F）脂肪變性和非脂肪變性HCC標本中M2巨噬細胞CIBERSORT評分比較。（G）PD-L1、αSMA、CD163免疫組化圖像。（H-J）PD-L1陽性HCC標本百分比（H）和脂肪性HCC與非脂肪性HCC的αSMA（I）和CD163（J）染色陽性區的比較。
4、耗竭T細胞、M2巨噬細胞和CAFs密切相互作用，構成脂肪性HCC中的免疫耗竭微環境
為了進一步表征脂肪性HCC中免疫耗竭TIME，作者通過Visium平臺上的空間轉錄組學檢查了脂肪性HCC中M2巨噬細胞、CAF和CTLs的形貌。將腫瘤切片分為1768個點，從每個點獲得轉錄組數據。首先，基于圖形聚類將所有點分成6個簇，簇2免疫細胞群高表達（圖4A-C）。ssGSEA顯示簇2基質信號和T細胞耗竭信號增強（圖4C）。作者提取了CD8A和NR4A1雙陽性斑點作為含有耗竭CTLs斑點，發現這些斑點幾乎有一半包含簇2（圖4D）。然后，作者比較了有或沒有耗竭CTLs位點之間的轉錄組圖譜（圖4E），發現耗竭CTLs位點中M2巨噬細胞標記物CD163和CAF標記物VIM表達增加，并且TGFB1水平升高（圖4F）。這些結果提示，M2巨噬細胞和CAFs可能產生TGF-β并促進周圍細胞耗竭，在脂肪變性HCC中形成免疫耗竭微環境。
圖4 耗竭T細胞、M2巨噬細胞和CAFs密切相互作用，構成脂肪性HCC中的免疫耗盡微環境。（A）在Visium平臺上基于圖形的脂肪變性HCC組織空間轉錄組數據聚類。（B）轉錄組數據聚類熱圖?；趫D的層次聚類分析將所有點分為6個聚類。（C）每個集群中免疫信號、基質信號和T細胞耗竭信號的富集分數。（D）餅狀圖顯示了每個集群中CD8A陽性和NR4A1陽性的耗盡CTL斑點百分比。（E）剖面圖上含有耗竭CTL斑點的位置。（F）小提琴圖顯示M2巨噬細胞標志物、CAF標志物和TGFB1在耗竭CTL斑點及其他部位的表達水平。
5、棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導的腫瘤細胞脂質積累可能促進脂肪變性HCC的免疫抑制
接下來，作者打算探究HCC中腫瘤內脂肪變性與免疫耗竭TIME之間的機制聯系。因此，首先進行基于脂質組學的總脂肪酸圖譜分析，發現脂肪HCC樣本中PA水平明顯高于非脂肪HCC組織。因此，作者在體外檢查PA積累對HCC細胞的影響。在Hep3B細胞中添加PA可誘導脂質積累（圖5A），上調PD-L1表達（圖5B，C）以及上調CSF1、CXCL8和TGF-β1表達（圖5D，E），所有這些都可以促進M2巨噬細胞極化和/或激活CAFs。PA處理的Hep3B細胞能上調共培養的人巨噬細胞系CD206和IL10的表達（圖5F）和共培養的人肝星狀細胞系TGFB1的表達（圖5G）。這些免疫抑制細胞因子和趨化因子的上調也在脂肪變性HCC體內觀察到（圖5H）。這些數據表明，PA在腫瘤細胞中積累促進免疫抑制，這可能有助于脂肪性HCC中免疫耗竭TIME的發展。
圖5 PA誘導的腫瘤細胞脂質積累可能促進脂肪變性HCC的免疫抑制。（A）加入牛血清白蛋白（BSA）或棕櫚酸（PA）24小時后Hep3B細胞的染色圖像。（B）添加BSA或PA 24小時后Hep3B細胞中CD274 mRNA表達水平。（C）流式細胞術分析加入BSA或PA 24小時后Hep3B細胞中CD274蛋白表達水平（左）和平均熒光強度（右）。（D）加入BSA或PA 24小時后Hep3B細胞中CSF1、CXCL8和TGFB1的mRNA表達水平。（E）加入BSA或PA 24小時后Hep3B細胞上清中CSF1、CXCL8和TGF-β1蛋白分泌水平。（F）與添加了BSA或PA的Hep3B細胞共培養3天后，巨噬細胞中CD206和IL10 mRNA的表達水平。（G）與添加BSA或PA的Hep3B細胞共培養3天后，LX-2細胞中TGFB1 mRNA的表達水平。（H）脂肪變性和非脂肪變性HCC標本中CD274、CSF1、CXCL8、TGFB1、CD206和IL10 mRNA的表達水平。
6、脂肪變性HCC患者對阿替利珠單抗聯合貝伐珠單抗聯合免疫治療敏感
作者回顧性分析了30名接受阿替利珠單抗聯合貝伐單抗治療的晚期HCC患者。根據化學位移MR，30名患者中有7名被歸類為脂肪性HCC（圖6A，B）。在5.4個月的觀察期間，脂肪性HCC患者均未出現疾病進展。因此，脂肪變性HCC患者PFS明顯長于非脂肪變性HCC患者。這些結果表明，脂肪變性HCC患者可能對ICI治療敏感，而腫瘤內脂肪變性可能是預測ICI治療HCC療效的一種新的影像學生物標志物。
圖6 脂肪變性HCC患者對阿替利珠單抗聯合貝伐珠單抗聯合免疫治療敏感。（A-B）脂肪性HCC代表性MR和HE圖像。（B）腫瘤活檢標本HE圖像。（C）根據HCC中是否存在脂肪變性進行分層的患者無進展生存期Kaplan-Meier分析。
結論：
總之，多組學分析根據預后或TIME對非病毒性HCC進行分層。作者進一步確定了HCC瘤內脂肪變性與免疫耗竭及免疫治療易感TIME之間的聯系。
參考文獻
Murai H, Kodama T, Maesaka K,et al. Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2022 May 14. doi: 10.1002/hep.32573. Epub ahead of print. PMID: 35567547.
