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Nature重磅 腫瘤微生物促進腫瘤異質性
腫瘤相關微生物群是人類癌癥類型腫瘤微環境的內在組成部分。到目前為止，腫瘤內宿主-微生物群研究在很大程度上依賴于bulk組織分析，這掩蓋了腫瘤內微生物群的空間分布和局部效應。近期，Nature期刊一篇題為Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer的論文揭示了微生物促進癌癥進展的作用。
背景
在癌癥患者的腫瘤中，惡性細胞被復雜的非惡性細胞環境包圍，這些細胞可能具有促瘤或抗癌作用，具體取決于其細胞類型和豐度。體外和臨床前動物模型表明，腫瘤相關微生物群中的細菌在癌癥發展、轉移、免疫監測、和化學耐藥性等方面發揮作用。有強有力的分子證據表明，至少33種主要癌癥類型存在腫瘤內微生物群，并且腫瘤內微生物群可以是細胞內的。然而，這些微生物的確切身份以及與患者腫瘤細胞或免疫細胞的相互作用尚未完全揭示。此外，腫瘤內微生物群的空間分布和特定的宿主-微生物細胞相互作用是否影響腫瘤微環境在很大程度上是未知的。本文研究了口腔鱗狀細胞癌（OSCC）和結直腸癌（CRC）中微生物和宿主細胞在空間水平的相互作用，揭示了腫瘤內微生物群如何促進腫瘤異質性。研究表明被細菌感染的癌細胞以單細胞的形式侵入其周圍環境，并將免疫細胞募集到細菌區域。腫瘤內微生物群的分布不是隨機的，具有促進癌癥進展的免疫和上皮細胞功能。
結果一：腫瘤內微生物群的異質性
作者對11例CRC患者腫瘤的44個組織進行了16S rRNA擴增子測序，觀察到門和屬水平的腫瘤內微生物群組成在個體患者腫瘤內有所不同。基于β多樣性聚類和樹狀圖分析顯示，超過三分之一的評估患者具有相對穩定的微生物組組成。然而，大多數患者在腫瘤內微生物組中表現出不同程度的異質性，這表明一部分患者的腫瘤組織中微生物分布不均勻。通過靶向RNA scope-熒光原位雜交成像確認了包括梭桿菌等細菌群落的異質空間分布，在同一腫瘤標本中觀察到細菌細胞生物量密集區域/區室和細菌陰性區域，通過定量PCR和微生物組分析驗證了RNAscope方法的結果。
為了進一步了解腫瘤內微生物群的空間分布和這些微生物的確切身份，作者通過10x Visium空間轉錄組學方法應用于CRC標本和OSCC標本。每個捕獲的微生物轉錄本（主要由核糖體RNA組成）兩側都有來自10x Visium捕獲點的條形碼——寡核苷酸序列，為整個腫瘤組織中的細菌轉錄本提供空間坐標。此外，來自單個微生物轉錄本的測序reads包含唯一的分子標識符（UMI），這能夠量化這些組織切片中活生物體的細菌轉錄負荷。使用GATK PathSeq評估所得測序reads在分類學上解析原位測序讀取到屬水平。在每個組織塊內，靶向RNAscope-FISH的連續組織載玻片染色數據證實了這些腫瘤內細菌的空間分布。總體而言，在口腔鱗狀細胞和結直腸癌腫瘤內分別有28%和46%的捕獲點鑒定出細菌轉錄本。對于檢測到細菌轉錄本數目統計，每個捕獲點鑒定的不同細菌屬的數量范圍為1至42，在口腔鱗狀細胞癌中中位數為8，在CRC腫瘤中為1至31，中位數為2。通過將這種空間轉錄組學方法應用于腫瘤內微生物群，能夠直接識別、量化和空間映射患者組織學完整腫瘤組織中的活細菌，突出了這些腫瘤組織中腫瘤內微生物群相互作用的復雜性。
結果二：腫瘤內生態位的微生物定植
鑒于腫瘤內微生物群在單個腫瘤組織中具有異質性分布，作者試圖確定這種空間分布是否與腫瘤微環境內的不同功能相關。通過GeoMx數字空間分析平臺量化了與抗腫瘤免疫和癌癥進展相關的77種蛋白質的表達譜。實施分段分析以富集感興趣組織區域的免疫或上皮細胞中提取到的蛋白質數據，這些數據通過RNA scope-顯色原位雜交（RNAscope-CISH）注釋為細菌陽性或陰性。
在OSCC口腔鱗狀細胞癌和CRC腫瘤的CD45免疫細胞富集區域內，細菌存在于高度免疫抑制的微生態位中，其特征在于成熟骨髓細胞富集以及免疫抑制分子ARG1和免疫檢查點蛋白CTLA4的上調。此外，在這兩種癌癥類型中，作者檢測到磷酸化ERK1和ERK2水平增加，這表明針對腫瘤內細菌的骨髓反應可能通過激活MAPK信號通路發生。在口腔鱗狀細胞癌中，與標本中的細菌陰性區域相比，T細胞抑制受體PD-1在細菌陽性微生態中過表達。這對應于口腔鱗狀細胞癌和結直腸癌組織中T細胞標志物（如CD3，CD8，CD4，CD27和CD44）的相對下調，以及增殖標志物KI-67的表達降低，并表明T細胞被排除在這兩種胃腸道癌癥的細菌定植區域中。
在兩種癌癥類型的PanCK+上皮腫瘤區域中，細菌定植區域的血管化程度低于細菌陰性區域。此外，作者還觀察到平滑肌肌動蛋白（SMA）的表達減少、細胞增殖水平較低。在口腔鱗狀細胞癌和CRC腫瘤組織的細菌定植區域中，作者檢測到腫瘤抑制因子p53的野生型構型的蛋白質表達顯著降低，表明細菌定位與TME內高度轉化的癌細胞相關。此外，細菌定植的微生態位顯著增加了CRC腫瘤中JNK、ERK1、ERK2以及P38的磷酸化水平，從而揭示了響應細菌而激活的信號通路。RNA scope和免疫組織化學（IHC）技術的結合支持了之前的發現，即PD-1在口腔鱗片標本的細菌陽性微生態位中過表達，此外KI-67水平顯著降低，這表明口腔鱗狀細胞癌和CRC腫瘤組織的感染區域比未感染區域具有更低的增殖潛力。
結果三：微生物驅動的單細胞異質性
腫瘤微環境中的單個宿主細胞存在于一系列人類癌癥類型中。然而，幾乎沒有關于侵襲細菌的身份的報道。為了研究TME中的細菌-宿主細胞-細胞間相互作用及其對宿主細胞轉錄組學的影響，作者通過引入靶向細菌16S rRNA保守區域的引物開發了INVADEseq方法，促進了來自細菌相關人類細胞的細菌轉錄本的cDNA文庫的生成，發現腫瘤內菌群以梭桿菌屬(34%)和密螺旋體屬(29.8%)的細菌種類為主，并通過基因集富集分析(GSEA)證實。隨后研究者為了確定與細胞相關優勢細菌屬是否會影響上皮信號通路。他們將梭桿菌或密螺旋體相關單細胞與上皮細胞群中的細菌陰性細胞進行比較發現在細菌陽性上皮細胞中，與癌癥進展相關的基因表達和細胞信號通路受到輕微影響，梭桿菌和密螺旋體主要與這些患者腫瘤中的上皮和單核細胞來源的巨噬細胞-v1（稱為巨噬細胞簇）相關。細菌感染的細胞表現出參與細菌感染反應的信號通路的顯著上調，例如TNF通路、與炎癥和缺氧相關的通路，以及通過上皮-間充質轉化（EMT）和p53信號通路影響癌細胞進展。與來自未感染的對照簇的細胞相比，細菌感染的細胞也顯示出與有絲分裂紡錘體形成和G2-M DNA損傷檢查點相關的細胞周期信號通路的下調。然而，INVADEseq無法區分細菌是否正在主動入侵巨噬細胞還是巨噬細胞是否正在吞噬細菌。總的來說，研究者表明腫瘤內和細胞相關的微生物群可以在免疫和上皮細胞群的單細胞水平上驅動患者腫瘤的異質性。
在巨噬細胞細胞簇中，作者發現吞噬細菌的巨噬細胞通過激活TNF、INFγ和IFNα參與炎癥反應的基因，以及通過JAK-STAT信號通路參與白細胞介素產生的基因，如IL1B、IL6和IL10的表達水平顯著增加。吞噬細菌的巨噬細胞也過表達趨化因子CCL2、CCL4、CCL8、CCL7、CXCL1和CXCL10。在分析與細菌相關的一般細胞時觀察到這種基因表達特征，以及在評估特定細菌屬（包括梭桿菌和密螺旋體）時也觀察到這種基因表達特征。此外，在標本水平上，每個口腔小細胞標本的細菌載量與強效中性粒細胞化學引誘劑CXCL8呈正相關，與CD3E的表達呈負相關，表明瘤內細菌定植的區域通過募集中性粒細胞和排除CD3+ T細胞，具有免疫抑制作用。
結果四：細菌誘導的癌細胞遷移
為了評估腫瘤內微生物群的主要成員與免疫或上皮癌細胞的直接相互作用，作者使用了共培養等方法發現腫瘤內微生物群在患者腫瘤細菌定植的微生態中對中性粒細胞的富集有積極作用。中性粒細胞募集和保留到感染了具核梭桿菌的癌細胞微環境中，表明腫瘤內微生物群在患者腫瘤的細菌定植微生態位內的中性粒細胞富集中起積極作用。中性粒細胞簇的形成伴隨著ERK和p38 MAPK的磷酸化水平顯著增加，以響應具核梭桿菌感染。這表明觀察到的ERK和p38 MAPK在患者腫瘤內細菌定植微生態位中磷酸化的上調部分是由對腫瘤內細菌的骨髓反應驅動的。作者還觀察到感染了具核梭桿菌的CRC上皮細胞會遷移到周圍的膠原凝膠中。為了識別相關的信號通路改變，分離含有具核梭桿菌的細胞進行轉錄組學分析發現暴露于具核梭桿菌導致了參與癌癥進展的信號通路的顯著上調，與細胞周期和DNA損傷修復等相關的信號通路下調。這些數據表明，源自人類CRC的具核梭桿菌能在細菌感染部位積極誘導骨髓細胞的招募，并促進CRC上皮細胞的轉錄變化，從而促進對周圍環境的入侵。
總結討論
從歷史上看，腫瘤異質性僅歸因于克隆擴增過程中癌細胞的內在遺傳改變，之前有研究也揭示了來自TME的外在因素在腫瘤發生中起重要作用。已知癌細胞與其他非惡性細胞群（如TME中的成纖維細胞，內皮細胞和免疫細胞）之間的細胞間相互作用通過隨著癌癥的發展促進轉化細胞的轉錄組變化來促進腫瘤異質性。隨著我們對TME的理解不斷加深，我們對影響腫瘤異質性的因素的理解也在提高。基于基因組學的研究表明，大多數主要類型的人類癌癥都含有腫瘤內微生物群，這些微生物群落因癌癥類型而異，特定的細菌可促進癌癥的發生和發展，影響患者對治療的反應，從而影響生存。然而，存在的內在異質性使得難以理解TME不同組成部分之間的相互作用，包括天然組織背景下的細菌-宿主相互作用。空間轉錄組學和scRNA-seq技術的發展使得TME的真核成分得以研究，但迄今為止，TME中腫瘤內微生物群的作用一直被忽視。在這項研究中，通過調整和應用這些技術，作者得出結論，腫瘤內微生物群在人類腫瘤中異質分布。此外，作者發現它是TME的基本組成部分，可以改變不同細胞的生物學過程，影響抗腫瘤免疫和癌癥上皮細胞的遷移。通過激活JUN和FOS家族的轉錄因子，細胞內細菌可以產生與癌細胞侵襲、轉移、DNA損傷修復和細胞休眠一致的基因標記。同樣，侵襲細菌負責招募髓系細胞以通過JAK-STAT信號誘導炎癥反應，通過將特定的白細胞介素和趨化因子分泌到周圍環境中來促進T細胞排斥和腫瘤生長。雖然本文關注的是胃腸道極端的兩種癌癥類型，但描述的工具和技術可以應用于分析迄今為止已被證明含有腫瘤內微生物群的33種主要癌癥類型。總的來說，腫瘤內微生物群在患者腫瘤內的分布不是隨機的，而是微生物群在具有支持癌癥進展的免疫和上皮細胞功能的微生態位中高度組織。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05435-0
