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免疫治療在抗腫瘤的方案中具有巨大的潛力。目前，主要在臨床應用的方案還是以靶向PD-1/PD-L1的免疫藥物。然而，一系列的臨床實驗觀察到的臨床預后遠遠達不到預期。這個問題引起各個腫瘤領域的專家爭相發表自己的看法。今天，我們來聽聽代謝組學對腫瘤的免疫治療有哪些見解吧。
首先，以一篇發表在《Cancer Cell》的文章來介紹今天的主題：“Lactic acid promotes PD-1 expression in regulatory T cells in highly glycolytic tumor microenvironments” ，乳酸促進高水平糖酵解的腫瘤微環境 (TME) 中調節性T細胞的PD-1表達
要素解讀：
Treg：可分為天然產生的自然調節性T細胞（n T-regs）和誘導產生的適應性調節性T細胞(a T-regs或i T-regs)，如Th3、Tr1等，其中Tr1細胞分泌IL-10；Th3細胞分泌TGF-β。腫瘤研究主要指CD+4 CD+25 Treg，CD+4 CD+25 Treg約占外周血及脾臟CD+4 T細胞的5%～10%，CD+4 CD+25 Treg除表達CD4分子和CD25分子外，其特征標志為高表達轉錄因子Foxp3。Foxp3不僅能作為CD+4 CD+25 Treg的標志分子，還是決定CD+4 CD+25 Treg功能的關鍵基因。
腫瘤代謝重編程：代謝重編程作為癌癥的特征之一，賦予了癌細胞在營養缺乏的腫瘤微環境（TME）中生長和增殖的潛能。正常細胞通常利用氧化磷酸化（OXPHOS）獲取營養。而Warburg發現，在乏氧的環境中，腫瘤細胞會通過消耗葡萄糖產生乳酸的方式獲取營養。
科學問題：
盡管眾所周知，合成代謝和氧化還原穩態是癌癥生長的關鍵，但仍需要澄清是否特定機制或因素驅動了這些代謝適應性以及這些適應性是否可以靶向抑制癌癥。在腫瘤代謝環境中，免疫細胞的免疫狀態的改變，是否達到足以引起免疫抑制或成為免疫治療的仍是亟待回答的問題。
文章摘要：
本研究表明，在高糖酵解性腫瘤(如MYC擴增的腫瘤、肝臟腫瘤)中，Treg細胞比效應T細胞獲得更高的PD-1表達。在腫瘤細胞消耗低葡萄糖的環境下，Treg通過單羧酸轉運蛋白1 (MCT1)積極吸收乳酸(LA)，促進活化T細胞核因子（NFAT1）轉位到細胞核，從而增強PD-1的表達，而效應T細胞的PD-1表達被抑制。PD-1阻斷激活表達PD-1的Treg細胞，導致治療失敗。我們提出，在高度糖酵解的TME中，LA通過上調PD-1表達，是Treg細胞在TME中功能的一個活躍檢查點。
結果展示：
Glycolytic activity of tumors is associated with PD-1 expression by eTreg cells in the TME
腫瘤的糖酵解活性與TME中eTreg細胞表達PD-1有關
Treg細胞通常被認為主要表達FOXP3。作者調研文獻發現：CD4 + T細胞被刺激后也會上調FOXP3，短暫表達FOXP3的活化CD4 + T細胞可能會污染Treg細胞[1]。因此，作者根據CD45RA和FOXP3對Treg細胞進行了分類: naive Treg細胞(CD45RA + CD25 low FOXP3 low CD4 +) (I); eTreg細胞(CD45RA CD25 high FOXP3 high CD4 +) (II); 非treg細胞(CD45RA CD25 low FOXP3 low CD4 +) (III)。
胃癌(GC)和非小細胞肺癌(NSCLC)樣本的測序數據納入該研究, 區分腫瘤微環境中高表達PD-1的eTreg (PD-1 high eTreg)與低表達PD-1的eTreg細胞 (PD-1 low eTreg細胞) （圖 1A）。
作者通過GSEA分析發現：在PD-1 low eTreg的GC和NSCLC腫瘤組織中，糖酵解相關基因集和MYC基因集顯著富集(圖1B)。
在PD-1 high eTreg的腫瘤中, LDHA和MYC的表達高于PD-1 low eTreg的腫瘤組織(圖1C)。在作者的測序隊列中，MYC表達與糖酵解信號顯著相關，與既往文獻報道一致：MYC是糖酵解的調控因子[2]。作者在MYC過表達(MYC high)的GCs和NSCLC中分析了CD8 + T細胞與eTreg細胞的比例，發現CD8 + T的PD-1水平明顯低于MYC低表達的GCs和NSCLC (圖1D和1E)。相比之下，MYC high GCs和NSCLC中eTreg細胞的PD-1表達明顯高于MYC low GCs和NSCLC (圖1E)。
基于此，作者推測在高糖酵解腫瘤中，eTreg細胞的PD-1表達可能上調。前有文獻報道，肝轉移病灶的糖酵解是通過缺氧促進的[3]。配對的NSCLC原發病灶和肝轉移病灶標本進行免疫組化(IHC)。與原發病灶相比，肝轉移病灶中糖酵解相關蛋白LDHA、PDK1和HIF1a的表達顯著增高(圖1F)。FOXP3 + CD4 + T細胞在肝轉移病灶中的PD-1表達也明顯高于原發病灶，而CD8 + T的PD-1表達降低(圖1G、1H)。
LA enhances PD-1 expression by eTreg cells, but not by CD8 + T cells, through MCT1
LA通過MCT1增強eTreg的PD-1表達，而不是CD8 + T細胞的PD-1表達
作者下面探索了eTreg細胞在高糖酵解腫瘤中獲得更高PD-1表達的機制。在NSCLC樣本中，區分出四種T細胞亞群，PD-1 +或PD-1 -CD8 + T和PD-1 +或PD-1 -eTreg (圖2A)。作者對四個T細胞亞群的基因表達進行富集分析，以確定與PD-1表達呈正相關的基因，特別是在eTreg中，而不是在CD8 + T中(圖2B)。在PD-1 + eTreg富集基因中高表達的基因，作者關注到編碼MTC1的SlC16A1基因(圖2C)。考慮到LA是腫瘤糖酵解的最終產物，作者研究了通過MCT1攝取LA是否可以誘導eTreg細胞表達PD-1。事實上，在PD-1 high eTreg的GC樣本中LA含量明顯高于PD-1 low eTreg的樣本(圖2D)。
流式細胞術檢測每個T細胞亞群的MTC1蛋白的表達情況。與LA代謝有關的MCT1和 LDHB[4], 在TME中PD-1 + eTre顯著增加,而在PD-1 + CD8 + T顯著表達下降(圖2 E,F)。細胞表面MCT1的表達與CD147的緊密相關[5]。流式細胞術分析了晚期GC樣本和小鼠腫瘤模型的腫瘤浸潤淋巴細胞。結果顯示，與CD8 + T相比，eTreg的MCT1、CD147和LDHB蛋白表達明顯更高(圖2G、2H)。作者的WB結果也證實了MCT1和LDHB的高表達。利用公共數據集中的染色質免疫沉淀測序(ChIP-seq)數據進行分析發現SLC16A1和BSG(編碼CD147)基因都含有FOXP3結合位點。在FOXP3過表達的Jurkat細胞中，MCT1和CD147的表達明顯高于對照Jurkat細胞。以上結果提示FOXP3可直接促進eTreg中MCT1和CD147的表達。
接著，作者分析了LA和PD-1在每個T細胞亞群中的表達之間的聯系，特別是eTreg。在低糖條件下，用抗CD3和CD28單克隆抗體 (mAbs) 體外刺激CD8 + T細胞和eTreg細胞，增加LA濃度。隨著LA濃度的增加，eTreg細胞的PD-1表達明顯升高。相反，PD-1在CD8 + T細胞中的表達與LA濃度成比例下降(圖2I和2J)。有文獻報道，當Treg通過MCT1從TME中吸收LA時，LA在Treg細胞中代謝為磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP被稱為代謝免疫檢查點，可以激活T細胞功能。PEP可增加細胞質鈣離子(CA2 +)濃度，促進NFAT1轉位到細胞核內。作者通過實驗發現，當在低糖條件下刺激CD8 + T細胞時，LA濃度的增加導致Treg細胞中PEP含量、CA2 +含量和核內NFAT1表達的顯著升高，而這些在CD8 + T細胞中沒有升高(圖2K、2L)。接下來，作者評估了LA濃度對CD8 + T細胞和Treg在低糖環境增殖和凋亡的影響。從PBMCs中分選出CD8 + T細胞和CD45RA-CD25high (eTreg)，單獨培養。在低糖條件下，與CD8 + T細胞相比，eTreg細胞增殖旺盛，凋亡減少。此外，在低LA或高LA環境中進行T細胞抑制實驗。用羧基熒光素雙乙酸丁二酰亞胺酯標記CD8 + T細胞與CD45RA- CD25 high CD4 + T細胞 (eTreg)。eTreg細胞在高LA(低糖)濃度時更具抑制作用(圖3A)。
NFAT1正向調控多種免疫分子的表達，包括PD-1。為了直接探討每個T細胞亞群的PD-1表達與MCT1之間的關系，作者對具有藥理抑制作用的人T細胞中分析MCT1的作用。來自健康個體的CD8 + T細胞和eTreg在低糖和高LA(15 mM)條件下使用MCT1抑制劑(AR-C155858, MCT1i)處理。結果發現eTreg的PD-1表達以濃度依賴性方式顯著降低，而MCT1i略微增加了CD8 + T細胞的PD-1表達。此外，MCT1i處理降低了eTreg細胞的增殖和抑制活性，并增強了細胞凋亡，但在高LA條件下的CD8 + T細胞中沒有發揮作用 (圖 3D)。作者還在基因敲除鼠中證實了這一結果。用抗CD3和CD28單克隆抗體在低糖和高LA(15 mM)條件下刺激CD8 + T細胞和敲除SlC16A1小鼠淋巴結中的Treg，CD8 + T細胞表達PD- 1顯著高于野生型小鼠。與之形成鮮明對比的是，基因敲除SlC16A1可顯著抑制Treg細胞的PD-1表達。接下來，作者研究了MCT1表達與高LA條件下Treg抑制活性之間的相關性。低水平的葡萄糖和高葡萄糖條件下，基因敲除Treg細胞中SlC16A1可降低免疫抑制活性，但在低葡萄糖(正常葡萄糖)條件下不會(Figure 3B, C)。綜上所述，在低糖高LA環境下，eTreg通過FOXP3控制的MCT1攝取LA，從而上調PD-1的表達，而CD8 + T細胞的PD-1表達呈相反趨勢。
PD-1 blockade enhances immunosuppressive activities of eTreg cells in a high-LA environment
PD-1阻斷增強eTreg在高LA環境中的免疫抑制活性
作者研究了PD-1阻斷是否可以增強低糖高LA條件下eTreg的抑制功能。高濃度的LA逐漸減少PD-1阻斷CD8 + T細胞中IFN-g的產生。相比之下，使用更高濃度的LA處理抗PD-1單克隆抗體可以增強eTreg的抑制活性。抑制試驗在低LA或高LA條件下進行。通過添加抗PD -1單抗，效應T細胞(Tresp細胞)在低LA環境中增殖增加，而在高LA環境中不增加(圖3E和3F)。當Tresp細胞與eTreg在低LA環境中共培養時，Tresp細胞優先被anti-PD-1單克隆抗體激活，而eTreg受抑制程度略次(圖3E)。相比之下，當Tresp細胞與eTreg在高LA環境中共培養時，eTreg細胞的抑制活性增強，PD-1阻斷使Trep細胞的增殖顯著下降，表明PD-1 + eTreg優先激活(圖3F)。因此, 在低糖-高-LA環境下, PD-1封閉可以增強eTreg的抑制效應對于CD8 + T細胞來說,高-LA誘導的PD-1 high eTreg細胞可能與抗PD-1治療無效有關。
MYC expression regulates the balance of PD-1 expression by T cell populations by governing glycolytic activities and creating a high-LA TME
MYC的表達通過調控糖酵解活性和產生高LA TME來調節T細胞群PD-1表達的平衡
作者在自己的臨床樣本觀察到MYC高表達 (圖1D和1E)，所以進行了下面的分析：使用動物模型來評估TME中腫瘤組織中MYC表達對T細胞PD-1表達的影響。作者建立了過表達MYC的MC-38(細胞系:MC-38 Myc)和B16-OVA(鼠黑色素瘤細胞系:B16-OVA MYC)(圖4A)。
糖酵解的關鍵調控因子hexokinase 2和LDHA在MYC過表達細胞系中的表達高于mock細胞系(MC-38 mock和B16- OVA mock) (圖4A和4B)。因此，與mock細胞系相比，過表達MYC的細胞系在體外和體內產生的LA含量顯著增加(圖4C和4D)。MC-38 Myc腫瘤在免疫受損和免疫正常小鼠中比MC-38 Mock腫瘤生長得更快(圖4G)。因此，與MC-38 mock腫瘤相比，MC-38 Myc腫瘤中CD8 + T細胞的數量(計數/腫瘤重量)顯著降低，盡管Treg的數量是相當的(圖4E)。與MC-38 Mock腫瘤相比，MC-38 Myc腫瘤中Treg的PD-1表達明顯更高，而CD8 + T細胞的PD-1表達在MC-38 Myc腫瘤中明顯低于MC-38 Mock腫瘤(圖4F)。anti-PD-1單抗的抗腫瘤作用在MC-38 Myc腫瘤中顯著受損(圖4G)。在B16-OVA模型中也觀察到了類似的結果(圖4E、4F和4H)。
Intrahepatic tumors enhance glycolysis and promote PD-1 expression by Treg cells in the TME
肝內腫瘤在TME中增強糖酵解，促進Treg細胞PD-1表達
臨床樣本數據(圖1G和1H)也表明，PD-1在肝轉移瘤中主要是由eTreg誘導表達的。將MC-38或B16-OVA細胞接種于C57BL/6小鼠皮下或直接接種于肺或肝。免疫印跡分析顯示，胰腺內腫瘤通過激活HIF1α 高表達PDK1和LDHA(圖5A,B)。肝內腫瘤組織間質液中LA濃度顯著升高(圖5C)。與過表達MYC的腫瘤相似，肝內腫瘤中CD8 + T細胞的數量和PD-1表達明顯減少，而Treg的PD-1表達明顯增強(圖5D、5E)。抗pd -1單抗治療對肝內腫瘤沒有表現出抗腫瘤作用(圖5F和5G)，而是激活了肝內腫瘤中的Treg(圖5H,I)，并抑制了APCs的成熟。因此，在肝內腫瘤中，PD -1單抗不能增強腫瘤反應性和/或活化的CD8 + T細胞(圖5J和5K)。同時，肝內TME中豐富的LA誘導Treg細胞表達PD-1，導致抗PD -1單抗治療的耐藥性。
Resistance of MYC-overexpressing tumors to PD-1 blockade is overcome by inhibiting the LA metabolism of Treg cells
MYC過表達腫瘤對PD-1阻斷的耐藥性是通過抑制Treg細胞的LA 代謝作用來克服的
作者研究了在TME中靶向腫瘤細胞的LDHA或Treg細胞的MCT1是否可以恢復MC-38 Myc瘤中抗PD -1單抗的療效。作者制備了敲除LDHA-MC-38 Myc (MC-38 Myc -LDHA RNAi)細胞。基因和藥物(GSK2837808A LDHi)抑制腫瘤細胞產生LDHA, 逆轉的CD8 + T細胞和Treg細胞表達PD1的平衡，和抑制了Treg細胞的功能,改善了抗PD-1mAbs的功效 (圖6 A-H)。此外，MCT1i抑制Treg細胞的MCT1可降低TME中Treg細胞的豐度和PD-1表達，并增加活化的CD8 + T細胞數量，從而導致抗PD-1單克隆抗體顯著抑制腫瘤生長(圖6I 6P)。因此，MYC過表達腫瘤對PD-1阻斷的耐藥性可以通過靶向腫瘤中的LDHA或Treg細胞的MCT1來克服。
Efficacy of PD-1 blockade in intrahepatic tumors is recovered by targeting LA metabolism of Treg cells
PD-1阻斷對肝內腫瘤的療效是通過靶向Treg細胞的LA代謝而恢復的
接下來，作者分了在TME中靶向腫瘤細胞的LDHA或Treg細胞的MCT1是否可以增強抗PD-1單抗在肝內腫瘤中的療效。與過表達MYC腫瘤相似, 在肝內腫瘤，這兩個從基因和藥物水平抑制了LDHA 表達，降低了LA濃度。逆轉T細胞的PD-1表達,抑制Treg細胞的功能,改善了anti-PD-1mAbs (圖7 A-H)。此外,抑制肝內腫瘤的Treg表達MCT1，可以降低Treg細胞PD-1表達水平，進而提高了anti-PD-1 mAbs的作用 (圖7I-p)。因此，抗PD-1單抗的抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤中的LDHA或抑制肝內腫瘤中Treg細胞的MCT1來恢復的。
High expression of glycolysis-related molecules predicts the efficacy of PD-1 blockade in clinical cohorts
在臨床隊列中，糖酵解相關分子的高表達預測PD-1阻斷的有效性
作者繼續觀察LDHA和MYC表達在PD-1阻斷治療患者中的預測作用。對接受PD-1阻斷治療的GC、NSCLC和惡性黑色素瘤患者進行分析。LDHA或MYC高表達的患者表現為無進展生存期(PFS)較短(圖8A,8B)。有MYC擴增的GC患者的PFS明顯短于無MYC擴增的GC患者(圖8C)。有肝轉移的GC和NSCLC患者接受PD-1阻斷治療后，PFS明顯短于無肝轉移的患者(圖8d)。總之，MYC擴增和肝轉移、使用免疫檢查點抑制劑相關。
總結：
果然是頂刊的生信分析，不僅公共數據庫的數據使用的巧妙，基礎實驗也做的扎扎實實。下面我們來梳理一番：
Step1提出問題-腫瘤的糖酵解水平與TME中eTreg細胞表達PD-1有關
Step2具體化問題-LA通過MCT1增強eTreg的PD-1表達，而不是CD8 + T細胞的PD-1表達
Step3 該問題的臨床意義-PD-1阻斷增強eTreg在高LA環境中的免疫抑制活性
Step4 明確該問題的潛在機制-MYC的表達通過調控糖酵解水平和產生高LA 來調節T細胞群PD-1表達的平衡
Step5確定肝癌中該問題作用-肝內腫瘤TME中的高水平糖酵解，促進Treg細胞PD-1表達
Step6該機制的臨床意義-MYC過表達腫瘤對PD-1阻斷的耐藥性是通過抑制Treg細胞的LA 代謝作用來克服的
Step7干預該機制的臨床意義-PD-1阻斷對肝內腫瘤的療效是通過靶向Treg細胞的LA代謝而恢復的
Step8問題的臨床應用-在臨床隊列中，糖酵解相關分子的高表達預測PD-1阻斷的有效性
點題：
作者通過體內體外實驗，提出了新的Treg的分子標記物（新分型），驗證了eTreg在高乳酸環境中抑制了CD8+T的抗腫瘤功能（新表型），最后提出LDHA和MYC是預測免疫治療的biomarker。看到這里，大家是不是對腫瘤微環境的乳酸代謝很感興趣呢？其實，生信人團隊在過去已經推出相應的專題及文獻解析：
21年3月份，我們團隊就關注了乳酸主題，解讀了一篇范文“Hypoxia-Associated Prognostic Markers and Competing Endogenous RNA Co-Expression Networks in Breast Cancer”。同月，解讀了一篇發表在《Nature Communications》的一篇缺氧多組學生信“Muti-omics analysis reveals contextual tumor suppressive and oncogenic gene modules within the actue hypoxic response”。
21年6月份，缺氧聯合免疫已經發到了《Briefings in Bioinformatics》，“A new thinking： extended application of genomic selection to screen multiomics data for development of novel hypoxia-immune biomarkers and target therapy of clear cell renal cell carcinoma”.
接著，我們團隊在21年7月份推出了乳酸專題，并解讀了綜述“Lactate modulation of immune responses in inflammatory versus tumour microenvironments”，總結出以下要點：高濃度乳酸形成的pH 6-6.6酸性環境促進腫瘤細胞的轉移、血管生成、治療抵抗；腫瘤微環境中的乳酸能夠發揮免疫抑制功能，通過誘導和募集免疫抑制相關細胞和分子，進而促進腫瘤的發展；腫瘤相關巨噬細胞中的組蛋白賴氨酸乳酸化程度高于其他組織中的組蛋白賴氨酸乳酸化。、
22年3月份，我們團隊進一步結合了熱點-外泌體，解讀了關于腫瘤缺氧微環境改變外泌體釋放的一篇綜述“Exosomes in the hypoxic TME: from release, uptake and biofounctions to clinical applications”。
22年4月，我們團隊解讀了一篇鑒定與HNSCC患者的預后，纖維化，缺氧，糖酵解相關基因signatures的6+文章。
22年5月，我們團隊繼續推出的CAFs專題，提到了《基質細胞依賴于“反向沃伯格效應”》，其中 CAFs 主要使用有氧糖酵解作為能量來源，導致乳酸分泌，然后被癌細胞吸收使用OXPHOS產生能量。這些代謝活性和酶催化反應導致內源性活性氧 (ROS) 增加，進而導致耐藥性。
那么看到這里，大家是否能察覺腫瘤代謝是一個高分切入點？多組學，免疫細胞亞群，TME浸潤非免疫細胞，外泌體，單細胞轉錄組以及非編碼RNA聯合分析，更多的腫瘤代謝與腫瘤免疫治療的潛在的分子機制等待我們的探索呀。
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