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哈嘍，好久不見(jiàn)~你們可愛(ài)勤勞的SHZ小編又回來(lái)啦~回歸的第一天，先帶大家解讀一篇預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型相關(guān)的文章，題為“The Aging-Related Prognostic Signature Reveals the Landscape of the Tumor Immune Microenvironment in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma”，近期剛剛發(fā)表在Frontiers in Oncology雜志上（IF：6.244）。雖然簡(jiǎn)單，但是干活滿(mǎn)滿(mǎn)！小編更是頭懸梁錐刺股，嘔心瀝血地為你們總結(jié)了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的萬(wàn)能公式——“找、篩、建、驗(yàn)、挖”。
數(shù)據(jù)來(lái)源
TCGA：https://portal.gdc.cancer.gov/
MSigDB：http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp
IBERSORT：http://cibersort.stanford.edu/
TIMER：https://cistrome.shinyapps.io/timer/
結(jié)果解讀
1.“找”—尋找HNSCC差異表達(dá)衰老相關(guān)基因
從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床隨訪數(shù)據(jù)，包括502個(gè)腫瘤樣本和44個(gè)非腫瘤樣本。從MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得11個(gè)已知的與人類(lèi)衰老相關(guān)的基因集，將這11個(gè)基因集作為預(yù)定義的衰老相關(guān)基因集。將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的HNSCC患者的測(cè)序基因與與預(yù)定義的衰老相關(guān)基因集進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)基因集在HNSCC樣品中顯著富集，如圖S1。
對(duì)上述7個(gè)基因集進(jìn)行LEA分析(leading edge analysis)，共鑒定出134個(gè)核心富集基因，定義為衰老相關(guān)基因（AGs）。然后，根據(jù)腫瘤和非腫瘤樣品中所有核心富集基因的表達(dá)，共獲得41個(gè)顯著上調(diào)的AGs，并分別用三種不同的繪圖方式(火山圖、熱圖、箱式圖)可視化這41種AGs的表達(dá)模式，如圖1。
2.“篩”—篩選預(yù)后相關(guān)的衰老相關(guān)基因
通過(guò)單變量Cox回歸分析，獲得12種差異表達(dá)的AGs（DKK1，SERPINE1，ADA，HMGA2，APP，CDKN2A，MIF，NEK6，ADM，BAK1，CDK6和PRNP）與HNSCC患者的OS顯著相關(guān)，如圖2A；
通過(guò)LASSO Cox回歸分析，消除預(yù)后相關(guān)的假陽(yáng)性AGs，進(jìn)一步篩選了7個(gè)AGs，包括BAK1，DKK1，CDKN2A，ADA，APP，MIF和ADM，如圖2B、S2。
通過(guò)多因素Cox回歸分析評(píng)估這7種預(yù)后相關(guān)AGs對(duì)HNSCC患者OS和臨床結(jié)局的影響（p <0.05，圖2B）。最后鑒定出具有獨(dú)立預(yù)后值的BAK1、DKK1、MIF和CDKN2A等4個(gè)AGs，用于OS預(yù)測(cè)，并進(jìn)一步應(yīng)用于建立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。
3.“建”—構(gòu)建衰老相關(guān)基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型
通過(guò)LASSO Cox回歸分析構(gòu)建了從四種選定的AGs中提取的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，其中BAK1，DKK1和MIF被鑒定為高風(fēng)險(xiǎn)基因，而CDKN2A被鑒定為低風(fēng)險(xiǎn)基因。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 = (0.2126) * BAK1 + (0.137) * DKK1 + (-0.0716) * CDKN2A + (0.2474)*MIF。
4.“驗(yàn)”—驗(yàn)證所構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性
在訓(xùn)練隊(duì)列（整個(gè)數(shù)據(jù)集，n = 502）和測(cè)試隊(duì)列（隨機(jī)選擇，n = 250）中驗(yàn)證了AGs簽名的預(yù)后價(jià)值。Kaplan-Meier生存分析顯示，在訓(xùn)練和測(cè)試隊(duì)列中，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS比低風(fēng)險(xiǎn)組的患者短（p <0.001;圖3A-B）。訓(xùn)練隊(duì)列中 AGs簽名的 ROC 曲線的 2 年、3 年和 5 年 AUC 值分別為 0.663、0.676 和 0.652（圖 3C）。測(cè)試隊(duì)列中ROC曲線的相應(yīng)2年，3年和5年AUC值分別為0.660，0.684和0.709（圖3D）。這些數(shù)據(jù)共同揭示了四種選定的AGs用于HNSCC預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性。
5.“挖”—挖掘預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型與其他因素的潛在關(guān)聯(lián)性
【小編有話說(shuō)】
通過(guò)前面的分析，我們已經(jīng)初步構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)準(zhǔn)確可靠的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，但是如果想要發(fā)表高分文章，僅僅構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，內(nèi)容略顯單薄，此時(shí)，我們就要充分發(fā)揮這個(gè)模型的潛在價(jià)值，進(jìn)一步挖掘預(yù)后模型與其他因素的關(guān)聯(lián)性，包括但不限于臨床病理特征、免疫評(píng)分及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平、免疫檢查點(diǎn)和免疫檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)等（此處應(yīng)該吹個(gè)牛皮兒：沒(méi)有生信做不到的，只有你想不到的）。
接下來(lái)言歸正傳，我們以本文為例，帶你領(lǐng)略風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的“附加玩法”
5.1）風(fēng)險(xiǎn)模型與總生存期及臨床病理特征的相關(guān)性
通過(guò)Wilcoxon檢驗(yàn)比較年齡、腫瘤分級(jí)、病理TNM分期、病理T分期、病理N分期、性別、治療方法等亞組間的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分差異，探討風(fēng)險(xiǎn)模型與HNSCC患者臨床病理特征的相關(guān)性，如圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤分級(jí)和病理性T分期顯著相關(guān)，而與年齡，病理TNM分期，病理性N期，性別和治療方法沒(méi)有關(guān)系（圖4A）。此外，單因素Cox回歸分析顯示，HNSCC患者的年齡，病理性N期和病理性TNM分期與OS顯著相關(guān)（圖4B）。多因素Cox回歸分析顯示，年齡、病理性N期、病理性TNM分期和放療與HNSCC患者的OS有明顯相關(guān)性（圖4B）。為了提供整合年齡、病理性N分期、病理性 TNM 分期和放療的 HNSCC 預(yù)后，構(gòu)建了生存預(yù)測(cè) C 指數(shù)為 0.764 的列線圖（p < 0.001）（圖 4C）。2年、3年和5年OS列線圖模型的校準(zhǔn)曲線顯示列線圖預(yù)測(cè)與實(shí)際觀察結(jié)果之間具有良好的一致性（圖4D）。
此外，按照年齡（<60歲和≥60歲），性別(男性和女性)，腫瘤分級(jí)（I級(jí)，II級(jí)和III級(jí)），病理性TNM分期（I-II期和III-IV期），病理性T期（T1-2和T3-4）， 病理性N期（N0和N1-2）和治療方式（放射治療和藥物治療）分為不同的亞組，進(jìn)一步進(jìn)行分層生存分析，如圖5。
結(jié)果顯示，除病理性 T1-2 亞組外（5J），在其余所有亞組中，高危組患者的OS明顯低于低危組（圖 5A-I， K–O）。這些結(jié)果表明，所鑒定的4-AGs風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)HNSCC的預(yù)后具有可靠的預(yù)測(cè)價(jià)值。
5.2）風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫評(píng)分及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性
首先研究了免疫評(píng)分與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的關(guān)聯(lián)。高危組的免疫評(píng)分顯著低于低危組（p <0.001）（圖6A）。隨后，通過(guò)CIBERSORT評(píng)估了高危和低危組之間22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平差異（圖6B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與低危組相比，高危組患者中記憶B細(xì)胞（p <0.05），CD8+ T細(xì)胞（p <0.001），濾泡輔助T細(xì)胞（p <0.001），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）（p <0.001）和活化肥大細(xì)胞（p <0.001）浸潤(rùn)水平較低，而靜息狀態(tài)NK細(xì)胞（p <0.01）、M0巨噬細(xì)胞（p < 0.01）、 M2巨噬細(xì)胞（p < 0.05）、靜息狀態(tài)肥大細(xì)胞（p < 0.001） 的浸潤(rùn)水平較高。然后，作者進(jìn)一步探索上述九種免疫細(xì)胞類(lèi)型與風(fēng)險(xiǎn)模型中所選AGs的關(guān)聯(lián)（圖6C-F）。
此外，基于TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)六種類(lèi)型免疫細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和浸潤(rùn)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，以評(píng)估4-AGs風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)HNSCC患者腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）的影響（圖7）。結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與B細(xì)胞（p <0.001，圖7A）、CD4 + T細(xì)胞（p <0.001，圖7B）和CD8 + T細(xì)胞（p <0.05，圖7C）浸潤(rùn)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，而風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與嗜中性粒細(xì)胞（p >0.05，圖7D）、巨噬細(xì)胞（p >0.05，圖7E）和髓狀樹(shù)突狀細(xì)胞（p >0.05，圖7F）的浸潤(rùn)水平未發(fā)現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。
為了探究AGs在TIME上的作用機(jī)制，作者進(jìn)一步研究了6種免疫細(xì)胞與4種AGs之間的關(guān)系，如圖8。結(jié)果顯示，與BAK1低表達(dá)組相比，BAK1高表達(dá)組中CD8 + T細(xì)胞（p <0.05）和嗜中性粒細(xì)胞（p <0.001）的浸潤(rùn)水平顯著較高，而B(niǎo)細(xì)胞（p <0.001）的浸潤(rùn)水平較低；在6種免疫細(xì)胞中，只有B細(xì)胞與DKK1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（p <0.001，圖8B），但對(duì)于CDKN2A，只有B細(xì)胞與CDKN2A的表達(dá)水平呈正相關(guān)（p <0.05，圖8C）。與MIF低表達(dá)組相比，MIF高表達(dá)組中B細(xì)胞，CD4 + T細(xì)胞，CD8 + T細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和髓系樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平均顯著降低（所有p<0.05，圖8D）。以上結(jié)果證明，風(fēng)險(xiǎn)模型中選擇的4個(gè)AGs（BAK1，DKK1，CDKN2A和MIF）在調(diào)節(jié)HNSCC患者TIME方面具有重要功能。
5.3）風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫檢查點(diǎn)和免疫檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)評(píng)分的相關(guān)性
計(jì)算CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT和SIGLEC15等8個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平，探討免疫檢查點(diǎn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和4個(gè)選定AGs的相關(guān)性。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HNSCC高危組中，CTLA4，PDCD1和TIGIT的表達(dá)下調(diào)，而PDCD1LG2表達(dá)上調(diào)（圖9A）。BAK1與CD274，LAG3和PDCD1LG2的表達(dá)呈極顯著的正相關(guān)，而與SIGLEC15的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖9B）。DKK1與PDCD1LG2的表達(dá)呈正相關(guān)，而與TIGIT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（p<0.05，圖9C）。CDKN2A與PDCD1表達(dá)呈正相關(guān)（p <0.05，圖9D）。MIF與CD274，CTLA4，HAVCR2，PDCD1，PDCD1LG2和TIGIT的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（p <0.05，圖9E）。此外，作者還評(píng)估了按風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和四種選定的AGs分層的高危組和低危組中免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)反應(yīng)評(píng)分的差異。結(jié)果顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)亞組和低表達(dá)亞組相比，高風(fēng)險(xiǎn)亞組、高DKK1表達(dá)亞組和高M(jìn)IF表達(dá)亞組的ICB反應(yīng)評(píng)分顯著升高（p <0.001，圖9F）。
總結(jié)
作者構(gòu)建了四個(gè)AGs (BAK1、DKK1、CDKN2A和MIF)的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，并在訓(xùn)練和測(cè)試數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗(yàn)證。Kaplan-Meier曲線和ROC曲線分析證實(shí)，AGs風(fēng)險(xiǎn)特征對(duì)HNSCC患者的預(yù)后具有準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)價(jià)值。相關(guān)分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫評(píng)分、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)，與免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)反應(yīng)評(píng)分呈正相關(guān)。高危組患者中，靜息狀態(tài)NK細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、 M2巨噬細(xì)胞、靜息狀態(tài)肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)水平較高，而記憶B細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞，濾泡輔助T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和活化肥大細(xì)胞浸潤(rùn)水平較低。高危組中CTLA4、PDCD1、TIGIT表達(dá)下調(diào)，而PDCD1LG2表達(dá)上調(diào)。此外，在風(fēng)險(xiǎn)模型中選擇的4個(gè)AGs在HNSCC的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和ICB反應(yīng)中具有重要作用。
不是廢話的廢話
有人說(shuō)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型已經(jīng)爛大街了，一點(diǎn)也不高大上，也發(fā)不了好文章了，但是為什么現(xiàn)在仍然可以看到很多優(yōu)秀的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型文章如雨后春筍般出現(xiàn)呢？吃不到葡萄說(shuō)葡萄酸的童鞋們，您可長(zhǎng)點(diǎn)心吧！過(guò)時(shí)落后的不是預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，而是老舊思維模式。小編總結(jié)預(yù)后模型5步玩轉(zhuǎn)法—“找、篩、建、驗(yàn)、挖”，可以說(shuō)是所有預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的經(jīng)典模式，“找、篩、建、驗(yàn)”是基礎(chǔ)，“挖”是升級(jí)，也是一篇文章的靈魂，感興趣的小伙伴，趕快學(xué)起來(lái)吧~
