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乳腺癌是威脅女性生命安全最高的惡性腫瘤之一，而且盡管相關的治療方法日趨先進和完善，但遠期生存率仍不理想，且乳腺癌容易向身體的其他區域轉移。因此乳腺癌的復發和轉移是延長生存期的主要障礙。小編今天就和大家分享一篇今年七月剛剛發表在Nature（IF:69.504）雜志上的高分文章。文章對睡眠與乳腺癌轉移的關系進行了研究，并進行了大量實驗同時結合生信分析從多個角度證明了睡眠對乳腺癌轉移有推動作用，文章的研究角度新穎、邏輯清晰很有啟發作用，長話短說，現在小編就帶大家一睹為快。
The metastatic spread of breast cancer accelerates during sleep
睡眠時乳腺癌的轉移擴散加速
一．研究背景
已經有研究發現在包括乳腺癌在內的多種癌癥類型中，循環腫瘤細胞(CTC)都是轉移級聯反應的先驅。然而，目前生理情況下調節CTC自發性內滲的因素尚不清楚，一般假設CTC是由浸潤性癌組織不斷生成，或者由機械信號(如手術)促進生成。此外，在患者和小鼠癌癥模型中，對癌癥轉移進展事件的確切時間，以及決定CTC轉移傾向的機制尚不清楚。因此，更好地了解這些過程可能會進一步促進癌癥的研究和治療。
二．文章摘要
該研究對乳腺癌患者和小鼠模型中CTC生成的動態模式進行了觀察，發現大多數自發的CTC內滲事件發生在睡眠期間。此外，該研究證明了靜息期的CTC很容易轉移，而活躍期產生的CTC則缺乏轉移能力。在機制上，CTC的單細胞RNA測序分析顯示，在患者和小鼠模型中，有絲分裂基因僅在靜息期顯著上調，從而使轉移能力更強。研究也發現關鍵的晝夜節律激素(如褪黑素、睪酮和糖皮質激素)對CTC生成動力學起決定作用，且胰島素直接促進體內腫瘤細胞增殖，但具有時間依賴性。因此，研究認為自發產生的具有高轉移傾向的CTC并非持續發生，而是集中在患者的休息階段。
三．實驗及方法
1. 患者樣本及細胞培養：研究納入了乳腺癌患者休息和活動階段的外周血樣本。研究培養了從1例性激素受體陽性乳腺癌患者制備的BR16細胞的CTC。研究也培養了人乳腺癌細胞MDA-MB-231 LM2，E0771.lmb小鼠乳腺癌細胞和4T1小鼠乳腺癌細胞(ATCC)。研究后續使用攜帶GFP -熒光素酶或mCherry -熒光素酶的慢病毒轉染LM2、BR16和4T1細胞，用攜帶CD90.1的慢病毒轉染lmb細胞。
2. 鼠實驗：研究將 LM2 - mCherry -熒光素酶細胞、BR16 - GFP -熒光素酶細胞及4T1 - GFP -熒光素酶細胞注射到8周的NSG雌性小鼠形成原位乳腺癌病灶。此外，研究也將4T1-CD90.1細胞注射于8周的BALB/c雌性小鼠，將E0771.lmb-CD90.1細胞原位注射于8周野生型大鼠或Bmal1基因敲除小鼠。接下來，分別在靜息期和活動期抽血進行CTC分析、器官解剖和IVIS生物發光成像。
3. 鼠的治療：研究在腫瘤發展后，用不同的晝夜調節激素治療小鼠。在腫瘤注射后10天開始使用褪黑素，此時腫瘤開始呈指數生長，并且外周血中尚未檢測到CTC。小鼠每日接受褪黑素或與luzindole 聯合治療，Luzindole在褪黑素處理前進行，褪黑素在靜息期(ZT :授時因子時間。ZT0:ZT0定義為早上6點開燈時)開始前給藥，接著在ZT0采血并進行CTC檢測。研究也在采血(ZT4:靜息期)前給予小鼠地塞米松，以避免下丘腦-垂體-腎上腺軸負調控環的激活。研究對腫瘤注射前4天的小鼠注射睪酮埋植劑，并保存至采血日(ZT4)。研究在腫瘤細胞注射后25天開始胰島素處置，以避免胰島素對腫瘤生長的影響。小鼠在每天ZT3(ZT3：靜息期)接受胰島素與葡萄糖并行處置，在ZT4和ZT16(活動期)進行采血和CTC檢測，所有給藥均采用腹腔注射的方式。
4. 時差綜合征實驗：研究在注射腫瘤1周后開始倒時差，將動物置于改變光周期的環境中，每2-3天提前8小時。在每個時差休息階段開始前1.5小時，每天給有時差反應的小鼠服用褪黑激素。靜息期開始采血并進行CTC分析。
5. CTC捕獲：研究對于患者樣本，采血后1小時內進行CTC捕獲。小鼠則采用心臟穿刺取血并立即處理。對于免疫功能低下的模型，樣本僅染色CD45，在免疫正常模型中，抗CD45染色與CD90.1染色同時進行，分別識別白細胞和癌細胞。測定捕獲的CTC數量包括單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇。
6. 直接轉移測定:研究利用自動單細胞收集系統(ALS) CellCelector對單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇進行操作，然后將每個類別的CTC注入受體NSG小鼠的尾靜脈。利用IVIS生物發光系統每周無創監測肺內轉移的發生和生長速度。
7. 免疫熒光染色和共聚焦分析及流式細胞術:研究對解剖的器官和原發腫瘤進行免疫熒光染色和共聚焦分析，小鼠腫瘤被切碎成碎片后進行流式細胞術。
8. ScRNA-seq:研究將收集的單個CTC、CTC簇和CTC -WBC簇轉入含有裂解液和抑制劑的單個試管中。并按照Smart-seq2方案制備擴增cDNA。使用Nextera XT (Illumina)制備文庫，在Illumina NextSeq500測序儀上以75-堿基對單讀模式進行測序，每個樣本的中位原始測序深度為164萬讀數。
9. RNA-seq分析：研究對測序讀數用Trim Galore進行了修整，采用FastQC對RNA-seq數據進行質量評估，使用STAR和GENCODE注釋并將修剪后的讀數與人類基因組參考序列進行比對。研究也對小鼠RNA的殘留污染進行了消除。讀數計數使用R/Bioconductor中的edgeR包進行標準化，并利用R/Bioconductor中的scater包對數據進行質量控制和可視化處理。標準化后，根據scran的getTopHVGs函數，使用生物成分最大的前500個基因的基因表達進行主成分分析。
10. 差異表達及GSEA: 研究利用 R/Bioconductor中的edgeR包計算差異表達，并利用Benjamini-Hochberg方法對P值進行了校正。使用R/Bioconductor中的clusterProfiler包進行GSEA。
四．主要內容及結果
1. 晝夜節律和CTC內滲
在文章第一部分，作者首先試圖確定在同一天的活動和休息的進展期乳腺患者的CTC豐度和組成。研究共納入30例患者(圖1a)，其中21例患者在采血時被診斷為早期乳腺癌，9例被診斷為ⅳ期轉移性乳腺癌。作者在休息階段的夜間采集樣本中發現了大量CTC，包括單個CTC、CTC簇和CTC -WBC簇(圖1a)。接下來為了檢驗這一發現的普遍性，并確定事件發生的精確時間，作者使用4種不同的乳腺癌小鼠模型移植乳腺癌細胞，并在腫瘤生長后，通過末端血液采樣和CTC捕獲來檢測隨時間推移自發產生的CTC。結果發現與患者數據一致，大多數CTC事件出現在小鼠休息期樣本中(圖1b,c)。作者進一步當以每4小時為間隔對24小時進行時間動力學分析時，觀察到CTC釋放的振蕩模式非常明顯(圖1b)。當聚焦于小鼠晝夜節律的靜止期(ZT4)和活動期(ZT16)兩個最具代表性的時間點時，研究觀察到在所有測試的模型中，CTC的絕對計數和標準化計數均有顯著差異(圖1c)。鑒于這些結果，作者得出結論，靜息期和活動期觀察到的CTC豐度的主要差異歸因于內滲率的差異。接下來作者嘗試用不同的方法打亂小鼠的生理節律，一方面改變正常的光暗(LD)周期，從而引發時差效應，另一方面，使用褪黑激素對對照組和有時差反應的小鼠進行治療。結果發現，與對照小鼠相比，時差誘導導致CTC減少。此外，作者也發現，褪黑素誘導會增加CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的產生，褪黑素受體拮抗劑luzindole則會干預這些情況，也就是說褪黑素可增加CTC生成，而luzindole可在不影響原發腫瘤大小的情況下減少CTC生成。然后，作者也觀察到，在各種光照條件下，CTC數量在靜息期均持續增加，這表明光照在CTC內滲中發揮關鍵作用。最后，考慮到CTC內滲的振蕩模式及其與晝夜節律的關系，作者測試這些模式是否在基因敲除小鼠中被消除，研究使用野生型BL/6小鼠(BL/6-E0771.lmb)和Bmal1純合子敲除小鼠(BL/6- Bmal1?/?-E0771.lmb)(圖1d)，發現對照BL/6-E0771的CTC計數在心臟穿刺和腫瘤引流管（ tumour draining vessel，TDV）中都遵循一種典型的振蕩模式。在lmb小鼠中，CTC計數的振蕩在BL/6-Bmal1?/?E0771中消失。綜上所述，這些結果表明在乳腺癌患者和小鼠模型中，單個和集群CTC的釋放都是在睡眠期間實現的。
2. CTCs在睡眠時的轉移能力
在文章的第二部分作者研究了晝夜節律的不同階段產生的CTC是否具有不同的轉移潛能。作者使用GFP或RFP標記的NSG-LM2異種移植模型，在腫瘤發生后分離出ZT4 (GFP標記)和ZT16 (RFP標記)自發脫落的CTC，最終分離出150個ZT4產生的GFP標記的CTC和150個ZT16產生的RFP標記的CTC，每個CTC都由110個單個CTC、35個CTC簇和5個CTC -WBC簇組成，接著作者在晝夜節律的不同時間點進行無腫瘤受體小鼠的尾靜脈注射來測量這些CTC的直接轉移能力(圖2a)。結果通過體內生物發光成像，作者發現在靜息期，尤其是ZT4的轉移負荷最高(圖2b)。接著為了分析這些轉移灶是否來源于ZT4或ZT16 CTC，作者使用抗GFP和抗RFP抗體進行了免疫組化分析，發現大多數轉移來自ZT4產生的GFP標記的CTC(圖2c)。這些結果表明ZT4 CTC對轉移灶的形成具有重要作用，并且在靜息期注射ZT4 CTC更容易形成轉移灶。接下來，作者試圖將這些發現擴展到更多的模型并精確量化靜息期與活動期單個CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的轉移能力，因此作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2異種移植模型，在腫瘤發生后，捕獲分離自發脫落的CTC。然后，分離出單個CTC、CTC簇的CTC和CTC - WBC簇的CTC，這些CTC分別處于靜息期(ZT4)和活動期(ZT16)，接著作者在(ZT12:定義為下午6點熄燈)通過無腫瘤受體小鼠的尾靜脈注射這些CTC，來測定其直接轉移能力(圖2d)。結果發現與ZT16期間獲得的CTC相比，ZT4期間獲得的CTC表現出更強的轉移能力(圖2e)。此外，作者也發現，與活動期的CTC相比，靜息CTC簇和CTC - WBC簇似乎具有比單個CTC更強的轉移形成特征(圖2e)。總之，這些結果表明， 靜息期不僅CTC內滲率增加，而且它們的轉移能力也會增強。
3. CTC基因表達的時間依賴性
接下來，在文章的第三部分作者試圖研究CTCs在靜止期和活動期轉移能力差異的分子特征。作者在小鼠晝夜節律的休息(ZT4)和活動(ZT16)階段分離出單個CTC, CTC簇和CTC - WBC簇，并分別對它們進行單細胞RNA測序(scRNA-seq;圖3 a)。在篩選了高質量樣本后，作者從NSG-CDX-BR16模型中獲得了138個CTCs，從NSG-LM2模型中獲得了108個CTCs，代表了ZT4和ZT16的所有類型CTC。使用主成分分析，作者發現時間點(ZT4 . ZT16)是驅動CTC基因表達變化的關鍵特征(圖3b)。在靜息期(ZT4)和活動期(ZT16)分離的樣本中，差異基因表達顯示ZT4 CTC中有121個上調基因，ZT16 CTC中有156個上調基因，作者也觀察到，大多數定義ZT4和ZT16表達特征的基因在所有類型的CTC中都被一致地高度上調，但在CTC簇和CTC -WBC簇中統計學顯著性最高。這與單細胞樣本中預期的較高變異性和較高脫落率一致。對ZT4和ZT16期間上調基因的基因集富集分析(GSEA)也發現ZT4期間支持有絲分裂和細胞分裂的通路具有高度一致的活性，而ZT16期間則富集到支持核糖體生物發生和基因翻譯的通路。此外，在從乳腺癌患者在同一天活動期和休息期分離的人類CTC中，作者發現了與在小鼠模型中觀察到的相同的基因表達模式和通路活性(圖3f)，且在靜止期和活動期的不同時間點也一致(圖3g)。考慮到CTC的半衰期短，作者推斷原發腫瘤也可以看到細胞增殖的振蕩變化。因此，作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2模型對增殖標志物Ki67及其CTC進行染色時，發現Ki67在靜息期顯著上調(圖3h)。總之，從患者和小鼠模型中分離出的CTC的分子基因表達分析展示了非常不同的基因表達模式。在睡眠期間，基因表達由細胞分裂和有絲分裂基因主導，而在活動期，則觀察到高核糖體生物發生活動。這種振蕩增殖時間不僅在CTC中觀察到，而且在原發腫瘤中也觀察到，這表明這是在疾病進展期間發生在乳腺癌細胞中的普遍現象。
4. CTC內滲的調控因子
在文章的最后一部分，作者對晝夜節律驅動的CTC生成和增殖的主要調節因子的機制進行了研究。作者分析了來自異種移植物和患者CTC的RNA-seq數據，以確定晝夜節律調節激素、生長因子或分子的受體表達水平，評估了受晝夜節律調節的候選受體表達。結果發現糖皮質激素受體、雄激素受體和胰島素受體的表達在單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇中高度出現，這表明它們的配體參與了時間點驅動的CTC生成和增殖(圖4a)。為了檢驗這一假設，作者首先用地塞米松或睪酮治療荷瘤小鼠。結果發現靜息期地塞米松單次治療(ZT2)和睪酮顆粒植入均導致靜息期峰值時間采樣時單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇顯著減少(圖4b,c)，且地塞米松或睪酮治療不影響原發腫瘤的大小，但觀察到睪酮治療小鼠的轉移負荷降低。此外，考慮到胰島素刺激與隨后的細胞生長和分裂之間的聯系，作者研究了胰島素是否也會影響乳腺癌細胞的增殖時間和內滲。作者每日在ZT3(靜息期)用胰島素和葡萄糖治療荷瘤小鼠1周，并分別定量靜息期和活動期的CTC豐度。結果發現，靜息期胰島素治療降低了ZT4的CTC內滲，增加了ZT16的CTC內滲(圖4d)，而原發腫瘤體積沒有顯著變化。作者也發現在靜息期使用胰島素治療也會逆轉乳腺癌細胞的增殖周期(圖4 e)。總之，這些研究結果表明，乳腺癌細胞的增殖和內滲是由關鍵的晝夜節律調節激素的每日波動決定的，這些激素的作用影響乳腺癌的轉移動力學。
到這里這篇文章的主要內容就介紹完了。文章聚焦于睡眠與乳腺癌轉移的關系，結合大量實驗與生信分析，證明靜息期CTC的內滲及轉移能力會增強，并對這一現象的機制進行了分析。文章邏輯清晰，角度新穎，有理有據，為有轉移傾向癌癥的時間控制性研究和治療提供了新的理論基礎。
