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如何利用免疫治療數據來構建預后模型？
最近關于預后模型的文章層出不窮，如何從免疫治療數據出發，建立可靠的預后標志物很重要。今天給大家分享一篇2022年1月20日發表在Aging（IF=5.955）上的文章，通過探索免疫相關的特征來預測結腸癌患者的免疫治療反應性、預后和診斷。
一 研究背景
結腸癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，目前在腫瘤篩查、早期診斷和治療方面有所進展，但結腸癌的預后依然有很多挑戰。近年來，越來越多的研究探討了腫瘤免疫微環境的功能，它可能在腫瘤發生中發揮重要作用。此外，許多研究已經確定了腫瘤微環境中的免疫相關特征，用于預測各種癌癥的預后，包括結腸癌。
免疫治療，尤其是免疫檢查點抑制劑（ICI），主要是利用宿主的免疫系統來對抗腫瘤的發展和轉移，達到控制和消除腫瘤的目的，這對結腸癌的治療起到了革命性的作用。然而，對ICI的反應率很少超過20%，這取決于幾個關鍵因素，包括突變負荷、腫瘤浸潤淋巴細胞和調節檢查點受體。然而，用于預測結腸癌患者免疫治療反應性的分子標志物的研究是有限的。
因此，探索有效的新型分子標志物來預測結腸癌患者的免疫治療反應性、預后和診斷至關重要。本研究重點關注在抗PD-L1隊列中發現的免疫相關特征，并系統地探討了它們在預測結腸癌患者的預后、免疫治療反應性和診斷方面的表現。首先，利用edgeR軟件包，通過比較抗PD-L1隊列中的應答者和非應答者，確定了免疫治療反應相關的差異表達基因（DEGs）。然后，將免疫治療反應相關的DEGs與免疫相關基因（IRGs）相交，得到免疫治療反應和免疫相關基因（immune-related genes , IRIGs）。然后，基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中的COAD隊列，利用單變量Cox回歸分析和多變量Cox回歸分析構建了由6個IRIGs組成的免疫治療反應和免疫相關風險評分（IRIRScore）模型，并在兩個獨立的基因表達數據庫（GEO）數據集（GSE39582和GSE17536）和抗PD-L1隊列中進一步驗證。此外，免疫相關的特征被應用于使用隨機森林算法建立預測模型。其中，TDGF1和NRG1顯示出優秀的診斷預測性能（AUC>0.8）。總之，目前的研究結果為免疫相關的免疫治療反應性、預后和結腸癌的診斷提供了新的見解。圖1顯示了本研究的整個分析流程。表1展示了抗PD-L1數據集的詳細信息。
二 主要結果
識別IRIGs
通過比較抗PD-L1隊列中的應答者和非應答者，作者發現了1323個免疫治療反應相關的DEGs（634個上調，689個下調）（圖2A。與1509個免疫相關基因（IRG）交叉后，得到108個IRIGs（圖2B）。KEGG分析結果顯示，IRIGs在細胞因子-細胞因子受體相互作用、神經活性配體-受體相互作用、JAK-STAT信號通路、cAMP信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關功能上明顯富集（圖2C）。此外，GO富集分析表明，IRIGs富集到與激素相關的功能，包括體液免疫反應、抗微生物體液反應、激素分泌調節和激素運輸（圖2D）。
建立免疫相關預后模型
作者探索了結腸癌患者的有效預后特征。基于訓練數據集，對IRIGs進行了單變量和多變量的Cox回歸分析，發現6個基因與整體生存狀態顯著相關（表2）。
各項預后指標的系數和危險比（HR）分別顯示在圖2E和,2F。TDGF1、IL13RA2和NRG1是保護因素（HR<1），而CRLF1、GRP和IL20RB是風險因素（HR>1）。然后，計算每個病人的IRIRScore。圖2G的散點圖顯示，低風險組患者的生存時間比高風險組長，這也得到了圖2H的明顯支持（P < 0.0001）。圖2G的熱圖顯示，危險因素在低危組的表達量低，在高危組的表達量高，而保護因素的趨勢則相反。IRIRScore模型在3、4、5年的OS的AUC分別為0.659、0.677和0.653（圖2I）。腫瘤尺寸較大的患者比腫瘤尺寸小的患者產生更高的IRIRScore（Kruskal-Wallis檢驗，P = 3.9e-6，圖3A）。有轉移的患者的IRIRScore高于無轉移的患者（Kruskal-Wallis檢驗，P = 0.012，圖3B）。有更多的遠處或更多的淋巴結參與的患者，其IRIRScore更高（Kruskal-Wallis檢驗，P = 3.2e-5，圖3C）。晚期患者的IRIRScore高于早期患者（Kruskal-Wallis檢驗，P = 0.00016，圖3D）。圖3E顯示，IRIRScore較高的患者產生的微衛星狀態更不穩定（Kruskal-Wallis檢驗，P = 0.015，圖3E）。
在預測預后和免疫治療反應方面驗證和評估已識別的免疫相關特征
為了驗證所確定的免疫相關簽名是否適用于不同的隊列，在兩個獨立的GEO數據集（GSE39582和GSE17536）中，基于訓練數據集的相同方法計算每個患者的IRIRScore。基于測試數據集，高危組患者的OS率明顯低于低危組。基于GSE39582的檢測數據，Kruskal-Wallis檢驗顯示，較高的IRIRScore與較高的T期（P = 0.00038）、轉移（P = 0.011）、N期（P = 0.0015）和晚期病理階段（P = 0.021）有關。此外，基于抗PD-L1隊列，作者發現對免疫療法敏感的患者的風險評分明顯低于非反應者，表明反應者的OS將比非反應者更好。
列線圖的構建和驗證
為了提高IRIRScore模型性能的準確性，并為預測結腸癌患者3、4、5年的OS概率提供一種定量和可視化的方法，作者構建了一個預后列線圖。在列線圖中，很容易估算出每個變量在積分制上的得分，并計算出3、4、5年后的生存概率（圖3F）。與其他變量相比，IRIRScore的得分點最高。森林圖顯示，包括年齡（>60歲）、晚期病理階段（III和IV）和IRIRScore在內的變量與OS明顯相關（P<0.05，圖3G），但微衛星狀態、StromalScore和ImmuneScore則沒有（P>0.05）。為了驗證提名圖的預測性能，作者繪制了校準曲線，觀察到預測曲線接近于理想曲線（圖3H-3J）。此外，提名圖的預測準確性（C-指數）已從0.63大幅提高到0.75，表明模型的功能良好。
探索潛在的免疫治療相關簽名
作者使用CIBERSORT方法估計了訓練數據集中結腸癌患者22種免疫細胞的比例。隨后，使用Kruskal-Wallis檢驗比較了高危組和低危組之間的免疫細胞類型的組成。此外，在T細胞CD8、T細胞CD4記憶靜止、T細胞CD4記憶激活、T細胞濾泡輔助、T細胞調節（Tregs）和嗜酸性粒細胞中發現了明顯的差異（P < 0.01，圖4A）。Kaplan-Meier曲線顯示，高水平的T細胞調節性（Tregs）與不良的OS顯著相關（P = 0.029，圖4C），而高水平的T細胞CD4記憶靜止與更好的OS顯著相關（P = 0.0071，圖4B）。22種腫瘤浸潤性免疫細胞中有10種與IRIRScore明顯相關（P＜0.05）。其中，T細胞調節性（Tregs）、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞M1、T細胞濾泡助手、T細胞CD8和巨噬細胞M2與IRIRScore呈正相關，而樹突狀細胞激活、漿細胞、T細胞CD4記憶激活和T細胞CD4記憶休息與IRIRScore呈負相關。
作者接下來使用maftools R軟件包對高危組和低危組的突變情況進行了繪制和比較。前20個明顯突變的基因是APC、TP53、TTN、KRAS、SYNE1、MUC16、PIK3CA、FAT4、RYR2、OBSCN、ZFHX4、DNAH5、PCLO、CSMD3、ABCA13、DNAH11、LRP1B、FAT3、USH2A和CSMD1（圖4D）。其中，APC的突變率在低風險組明顯較高（P = 0.000716，圖4E），而MUC16的突變率在高風險組明顯較高（P = 0.0154，圖4E）。然而，APC或MUC16的突變狀態與患者的OS沒有明顯關聯（圖4F）。此外，作者還計算了每個樣本的TMB值，并將其可視化（高危組的中值：2.66/MB；低危組的中值：2/MB，圖4G）。如圖4H所示，高危組患者的TMB值明顯高于低危組患者（P = 0.00031）。此外，應用Wilcoxon檢驗對兩組之間的免疫檢查點抑制劑靶點的表達進行統計學比較。結果發現，高危組的表達水平明顯較高（P < 0.001，圖5）。
識別的IRIGs作為潛在的診斷生物標志物
作者發現6個IRIGs中的5個在腫瘤和正常樣本之間有明顯的差異表達（P < 0.05，圖6A）。其中，TDGF1和GRP在腫瘤樣本中上調，而NRG1、CRLF1和IL20RB在腫瘤樣本中下調。用RF算法建立預測模型，用ggroc R軟件包計算并繪制每個IRIG的AUC（IL13RA2：0.579；TDGF1：0.813；NRG1：0.933；CRLF1：0.795；IL20RB：0.625；GRP：0.724，圖6B）。其中，TDGF1和NRG1顯示出優秀的診斷預測性能（AUC>0.8）。圖6C-6F顯示了CRLF1、NRG1在蛋白水平上的分布和表達。
三. 總結
在這項研究中，作者首先利用免疫治療數據識別出一些癌癥預后相關的免疫分子特征，以預測結腸癌的免疫治療反應性、預后和診斷，并在多個隊列中驗證了所發現的預測預后和TNM分期的免疫相關特征。總體來說，這篇文章是一個不錯的預后分析思路，值得大家借鑒！
參考文獻
Cao L, Ba Y, Yang J, Zhang H. Exploring immune-related signatures for predicting immunotherapeutic responsiveness, prognosis, and diagnosis of patients with colon cancer. Aging (Albany NY). 2022 Jun 20;14(12):5131-5152. doi: 10.18632/aging.204134. Epub 2022 Jun 20. PMID: 35748788; PMCID: PMC9271306.
