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最近小編發現，除了腫瘤分型，基因集、明星通路、熱點表型建模外，既往被高強度研究過的癌基因還有巨大的挖掘價值。今天就給大家帶來一篇以Ras相關蛋白為主角的生信meta研究，并非常規的生信套路文章，研究思路設計嚴謹，這就給各位解讀一下！
文章“Identification of RASSF1A promoter hypermethylation as a biomarker for hepatocellular carcinoma”發表在《Cancer Cell Int》，影響因子6.26分。
背景介紹:
RAS相關區域家族1A（RAS association domain family 1A, RASSF1A）是近年來新發現的一個候選腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG），該基因的失活在多種人類腫瘤的發生發展過程中起重要作用。雖然基因缺失和點突變可引起基因的失活，但大量研究表明，該基因的失活與其啟動子高甲基化有關。這種表觀遺傳學機制可使多種抑癌基因失活，并被證實為腫瘤發生發展的主要原因。
結果展示：
Screening of studies
文獻篩查
首先制定文獻檢索策略：search strategy of (HCC OR hepatocellular carcinoma OR liver cancer) AND (hypermethylation OR methylation OR epigenetics) AND (RASSF1A or RASSF1 or Ras association domain family 1 A)
經過文獻檢索，作者初步納入479篇研究(圖1)，首先排除重復文獻208個，排除與研究內容無關文獻的218個。此外，有15個研究觀測指標與作者研究內容不相關被排除。最后，共計44個研究負荷作者的研究主題：12項研究提供了肝癌的RASSF1A啟動子甲基化頻率數據，并評估了這種甲基化與臨床病理特征的相關性。29項研究僅提供了肝癌患者的RASSF1A啟動子甲基化頻率，3項研究僅提供了肝癌患者的臨床病理特征。
Characteristics of the enrolled articles
納入文獻的基線資料
入選研究的特征如表1所示。研究年限從2002年到2019，共計44項病例對照研究，包含4777名肝癌患者。納入研究的地域較廣，有28篇文章來自亞洲。8篇文獻來自美國，其次是非洲(n = 5篇)，意大利和德國各發表一篇。檢測樣本主要有三種來源，包括組織(n = 31)、外周血(n = 11)以及組織和外周血同時調查(n = 2)。在入組的研究中，肝癌患者為病例組，正常樣本為對照組，并被分配到非腫瘤組和正常組。在評估肝癌診斷效率的研究中，采用血液（n=11），采用組織（n=31），同時檢查了血液和組織（n=2）。采用異質性檢驗評估入組研究中RASSF1A的甲基化狀態。采用Newcastle-Ottawa scale (NOS) 評估41個報道病例和對照組RASSF1A甲基化頻率的研究質量。評分范圍5 - 8分，表明具有相對較高的質量。另外3項研究僅報道肝癌的床病理特征，未進行評估。
Effect of RASSF1A promoter hypermethylation on HCC in the pooled analyses
Comparison of RASSF1A promoter hypermethylation between HCC and non-tumor groups
匯聚分析RASSF1A啟動子高甲基化對肝癌的影響
比較肝癌組與非腫瘤組RASSF1A啟動子甲基化狀態
作者匯聚了34研究，涉及2075名肝癌樣本和2276名非肝癌樣本。通過meta分析評價RASSF1A基因啟動子上甲基化與肝癌發生率的關系(圖2)。作者發現RASSF1A基因啟動子甲基化頻率與較高的患肝癌風險相關, (odds ratio [OR] = 6.87, 95% confidence interval [CI] = 4.98–9.50, P < 0.001)，結果異質性中等(I 2 = 64.1%, P = 0.000)。
作者進一步按樣本類型(血液和組織)、檢測方法和樣本大小對納入研究進行亞組分析，探索可能的異質性來源。亞組分析顯示，RASSF1A基因啟動子高甲基化與患肝癌風險顯著相關(blood: OR = 6.93, 95% CI = 4.12–11.65, P < 0.001; tissue:OR = 7.12, 95% CI = 4.78–10.59, P<0.001)。此外，在檢測方法的亞組分析中，RASSF1A基因啟動子高甲基化與肝癌風險顯著相關(MSP: OR = 7.30, 95% CI = 5.17–10.29, P < 0.001; others: OR = 6.20, 95% CI = 3.13–12.30, P < 0.001)。樣本大小亞組分析結果與匯聚分析的結果是一致的(≥ 100:OR = 6.74, 95% CI = 4.28–10.61, P<0.001; < 100:OR = 6.67, 95% CI = 4.46–10.00, P < 0.001) (圖3)。
Comparison of RASSF1A promoter hypermethylation between HCC and normal groups
HCC組與正常組RASSF1A啟動子高甲基化水平比較
作者接下來首先利用來自26項研究的1898名肝癌樣本和1002名正常樣本的檢測數據評估RASSF1A基因啟動子甲基化如何患肝癌的風險(圖4)。
meta分析提示與對照組相比，RASSF1A基因的啟動子甲基化與肝癌風險顯著相關(OR = 31.05, 95% CI = 13.73–70.20, P < 0.001)；但是，納入文獻存在較高的異質性(I 2 = 79.6%， P = 0.000)。進行亞組分析后的meta結果顯示，RASSF1A啟動子甲基化與HCC風險顯著相關(圖3)。
Relationship of the promoter hypermethylation of RASSF1A with the clinicopathological features
RASSF1A啟動子高甲基化與臨床病理特征的關系
作者通過提取納入研究的肝癌患者基線數據分析RASSF1A基因啟動子高甲基化與臨床病理特征相關性。臨床病理特征與RASSF1A基因的相關性展示在表2。Meta分析顯示RASSF1A啟動子的高甲基化與腫瘤大小，乙型肝炎病毒(HBV)感染顯著相關。與性別，年齡，丙型肝炎病毒(HCV)，甲胎蛋白(AFP)水平，腫瘤數量,肝硬化,組織病理學,腫瘤分化或門靜脈侵犯無顯著相關性,
Meta regression and sensitivity analyses
Meta回歸和敏感性分析
作者對兩組中RASSF1A啟動子高甲基化與肝癌風險的薈萃回歸分析結果顯示，樣本類型、檢測方法和樣本量存在趨勢。但是，meta結果中也檢測到異質性。對此，作者利用亞組分析評估了不同特征對異質性的影響程度，然而大多數亞組的P值＞0.05，沒有統計學意義。兩組的異質性區間為9.70% ~ 8.14%，殘差異質性水平較高。由于入組的研究缺乏足夠的數據，作者沒有將其他可能導致異質性的因素納入meta回歸分析。
接下來，作者通過敏感性分析進一步研究兩組合并結果的穩健性，采用隨機效應模型逐個剔除納入的研究。沒有一項研究對匯集的結果有顯著的影響，表明作者的估計是穩健和可靠的。
Publication bias
發表性偏移
對于非腫瘤組，漏斗圖似乎不對稱，Begg’s檢驗(P = 0.021),提高發表性偏移。但是Eegg’s (P = 0.208)沒有檢測出發表性偏移。隨后，采用修剪和填充法評估發表偏倚對meta結果的影響。最后，作者通過增加10個負向結果的研究再次生成了對稱漏斗圖。作者通過meta分析得到的這些結果仍然顯著。同樣，對于正常組，Egger s檢驗和漏斗圖顯示存在潛在的發表偏倚。隨后，7個負性研究通過修飾和填充方法進行填充，合并分析發現RASSF1A啟動子甲基化與肝癌風險顯著相關。
Association of the promoter hypermethylation of RASSF1A with HCC related prognoses
RASSF1A啟動子高甲基化與HCC相關預后的關系
Baseline patient characteristics
患者基線特征
作者接下來，評估了TCGA的肝癌樣本及非腫瘤樣本的RASSF1A-DNA甲基化數據，選取原位定位于RASSF1A啟動子區域的11個探針(cg13872831、cg24859722、cg04743654、cg00777121、cg08047457、cg12966367、cg21554552、cg25747192、cg06172942、cg25486143、cg27569446)，均含有RASSF1A基因CpG島A (chr3: 50340373–50341109)。
在TCGA隊列中，肝癌樣本中的RASSF1A啟動子甲基化水平顯著高于鄰近的非癌性肝組織。根據探針甲基化水平，所有樣品分為低甲基化組(n = 196)和高甲基化組(n = 184)。在380例TCGA來源的肝癌樣本中，349例有總生存期(OS)和生存狀態的信息，而342例有無病生存期(DFS)和復發狀態的數據。
RASSF1A啟動子高甲基化在預測HCC相關預后中的作用
作者進行Kaplan Meier生存分析發現，RASSF1A基因啟動子高甲基化的患者的總生存期OS較差, 但是DFS高于低甲基化組。另外，受試者工作特征(ROC)曲線分析，RASSF1A基因啟動子高甲基化預測肝癌患者1、2、3和5年OS的曲線下面積分別為0.51、0.60、0.60和0.58。同時，RASSF1A基因啟動子高甲基化預測肝癌患者1、2、3和5年DFS的時間依賴性AUC值分別為0.61、0.69、0.63和0.73。據此，作者推斷RASSF1A基因啟動子甲基化狀態具有較高的敏感性和特異性(圖5)。
結論：
Meta分析納入了涉及4777人的44項研究。肝癌患者RASSF1A啟動子甲基化率明顯高于非腫瘤患者和健康個體，且與乙肝病毒(HBV)感染陽性和腫瘤大小顯著相關。Kaplan Meier生存分析顯示，RASSF1A啟動子高甲基化的HCC患者預后較差。受試者工作特性曲線證實，RASSF1A啟動子甲基化可能是肝癌相關預后的標志。
看到這里，大家有沒有發現2022年的生信文章已經不是簡單的追熱點了呢？過去因為有R語言的門檻在，TCGA和GEO中海量的測序數據讓大家吃了一波紅利，但是往后，R語言已經不是門檻，更多具備meta經驗、基礎研究背景的有心人已經加入生信發文的梯隊。所以，要想在2022年獲得一篇不錯的paper，就需要找到有經驗、有能力小伙伴來輔助大家進行生信研究呀。
