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今天給大家分享一篇發表在Cancer Cell（IF:38.585）上的文章:
Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma
空間多組學解析膠質母細胞瘤中腫瘤-宿主的相互依賴性
一．研究背景
高級別和低級別膠質瘤的單細胞RNA測序（scRNA-seq）研究表明，腫瘤內異質性和細胞狀態的動態可塑性是惡性腦腫瘤的標志。這種動態適應發生在四種不同的狀態中，即間充質樣（MES樣）、神經祖細胞樣（NPC樣）、星形膠質細胞樣（AC樣）和少突膠質前體細胞樣（OPC樣）狀態。盡管腦腫瘤呈現出與健康大腦相似的轉錄適應和進化，但它們長期以來一直作為一個獨立實體進行研究，忽略了局部微環境在腫瘤發生中的作用。然而，最近的文獻報道腫瘤細胞與神經元環境的局部相互作用，其中神經元、神經膠質細胞和免疫細胞對復雜且動態異質的神經膠質瘤網絡有貢獻。由于空間組織信息的丟失，單細胞分析僅提供細胞相互作用的間接推斷。在大腦中，空間組織和功能密切相關。因此，研究者假設中樞神經系統惡性腫瘤在功能和空間上也是有組織的。空間轉錄組學（stRNA-seq）是一項新技術，它允許在原位表征細胞相互作用和組織，從而破譯惡性腦腫瘤的生態系統。鑒于scRNA-seq和stRNA-seq具有互補性，兩種技術的整合至關重要。細胞通訊和代謝是對腦癌動態適應具有決定性影響的兩個關鍵因素，促進生長、浸潤和治療耐藥。這些代謝改變可歸因于腫瘤代謝的微環境或區域異質性。例如，已經證明，缺氧導致的強制代謝惡化顯著驅動轉錄適應和基因組不穩定性。腫瘤細胞與免疫系統之間的細胞相互作用也越來越受到關注，最近的一項研究證明，表觀遺傳免疫編輯驅動獲得性免疫入侵程序，導致膠質母細胞瘤中出現的空間異質性景觀。這些研究進一步強調，需要在空間分辨的背景下，全面研究膠質瘤由于微環境而產生的各種轉錄適應性。該研究旨在提供膠質母細胞瘤與其局部微環境的空間分辨轉錄程序和細胞相互作用圖譜。
二．研究方法
研究者通過空間分辨的轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學來表征膠質母細胞瘤，確定以免疫和代謝應激因素為標志的微環境，揭示了局部區域腫瘤-宿主的相互依賴性，從而導致空間特定適應性轉錄程序的產生。此外，他們將膠質母細胞瘤干細胞模型植入人類和嚙齒動物新皮質組織模擬各種環境，證實了轉錄狀態源于對各種環境的動態適應。
三．研究結果
1、膠質母細胞瘤（GBM）的空間分辨轉錄組圖譜
為了表征GBM的空間結構，研究者產生了28個樣本的空間轉錄組學（stRNA-seq）圖譜，共產生了88,793個spots。研究者還補充了來自組織的空間代謝組學和蛋白質組學（用于stRNA-seq輔助整合分析（圖1A）。基于相互最近鄰（MNN）的水平整合和共享最近鄰（SNN）聚類顯示，非惡性樣本在患者之間表現出相似性。惡性樣本以獨特的基因表達譜為特征，聚類間樣本多樣性的高香農熵進一步證實了這一點（圖1B）。若惡性起源的樣本顯示出顯著較低的熵，則表明該簇由個體患者的spots組成（圖1B和1C）。這些發現與最近的單細胞研究一致，即大量個體拷貝數改變和突變譜有助于患者間的異質性，從而導致個體轉錄譜改變。在所有樣本的88,793個spots中，63,121個spots來自惡性樣本，其中46,459個spots,每個spot中腫瘤細胞含量的比例在95%以上（圖1C）。為了研究腫瘤浸潤區域，作者根據Ivy GAP組織學分類系統預測了spots組織學表型（圖1D）。與組織病理學特征相比，具有低腫瘤細胞頻率的樣本主要包含浸潤區域，在這些區域中，健康皮質內很少有腫瘤細胞的存在（圖1E）。
2.解析空間分辨率的轉錄異質性
研究者通過與現有的轉錄和組織學分類數據聯系來重現空間轉錄模式。通過空間轉錄組學的分析，發現了五個轉錄模式，并且90%的腫瘤中存在這5個模式（圖2A）。隨后研究者整合了患者空間加權相關矩陣，然后是層次聚類，證實了五個空間不同轉錄模式在空間中是分離的（圖2A）。通過探索這些不同的程序，研究者確定了兩個與膠質相關基因（如GFAP、AQP4、VIM、CD44）高表達相關的空間不同的轉錄模式。雖然這兩個模式都顯示了神經膠質譜系，但其中一個與放射狀神經膠質相關基因（如HOPX、PTPRZ1）表達增加相關，稱為“Radial Glia”；另一個顯示了炎癥相關基因（如HLA-DRA、C3）和INF-γ通路的功能富集，稱為“Reactive Immune”（圖2A）。其余的轉錄模式顯示出與神經膠質譜系一致，并根據其神經稱為“Neuronal Development”或者少突膠質細胞起源以“Spatial OPC”命名（圖2C）。第五個轉錄模式，進一步稱為“Reactive Hypoxia”，該模式與缺氧反應（如VEGFR、HMOX1、GAPDH）和糖酵解（如LDHA、PGK1）基因相關，表明與低濃度氧結合的代謝改變在某些區域驅動轉錄上不同的狀態（圖2A、2B）。
3.不同的空間轉錄模式獨立于細胞周期
為了確定檢測到的不同的空間轉錄模式是否存在于所有細胞周期階段，研究者根據其轉錄和細胞周期程序對所有spots進行分類。轉錄模式均勻分布在所有細胞周期階段（圖2A）。為了進一步將發現與現有分類系統相結合，對已有的bulkRNA-seq、scRNA-seq和stRNA-seq上不同的轉錄模式分類進行了空間加權回歸，以映射空間關系（圖2C）。利用Neftel等人的scRNAseq數據集對不同空間轉錄模式得分最高的基因特征進行整合，證實Radial Glia、Spatial OPC和Neuronal Development三個轉錄模式分別與AC-like、OPC-like和NPC-like具有很大的重疊。與Richards等人的數據相比，上述所有模式均與神經發育表型具有大部分重疊（圖2C）。Reactive Hypoxia模式與MES-like亞型具有很大部分重疊，特別是缺氧依賴性“MES2”狀態（圖2C）。
4.不同的空間轉錄模式和亞克隆結構
拷貝數改變（CNA），包括癌基因的局灶性擴增或腫瘤抑制因子的丟失，是惡性細胞的標志，據報道，這些細胞會導致治療耐藥和腫瘤復發。在已知的細胞狀態分類中，獨特的CNA與特定狀態相關聯，但在單個腫瘤細胞中分布不均勻。在Reactive Hypoxia相關spots中，研究者發現CNA的顯著累積作為獨立的亞克隆事件發生（圖2D）。接下來，作者研究空間上不同的轉錄多樣性是否可以直接反映腫瘤內亞克隆。他們通過患者特異性的CNA進行層次聚類重建克隆結構。共鑒定出57個亞克隆，每個樣本含有2至6個亞克隆不等（圖3A）。然后，確定了每個亞克隆中樣本、不同的空間轉錄模式的分布（圖3B和3C）。分析表明，在26.32%的亞克隆中，單一轉錄模式占主導地位（每個亞克隆的spots數超過75%）。這些結果表明克隆結構對不同空間轉錄模式的發生影響不大，盡管亞克隆偶爾偏向Spatial OPC（8.77%）或Reactive Hypoxia模式（10.52%）（圖3D）。
5.與Reactive Hypoxia模式相關的代謝改變
為了進一步探索空間上不同的Reactive Hypoxia模式，研究者進行空間代謝組學研究（圖4A）。進一步分析識別出三個顯著的代謝亞組（圖4A、4B）。功能代謝分析顯示第一個代謝模塊（M-G1）中磷酸戊糖途徑顯著富集。第二個代謝模塊（M-G2）的特征是磷酸腺苷酸代謝的富集。第三個代謝模塊（M-G3）在糖酵解和氨基糖代謝顯著富集（圖4C）。
6.Reactive Hypoxia模式積累染色體改變
由于缺氧已被證明會導致DNA損傷應答和修復基因的表達改變，從而抑制重組介導的DNA雙鏈斷裂修復，增加突變率和CNA。為了研究假設，探索了Reactive Hypoxia通路富集的區域，該區域還富集糖酵解途徑（圖4D）。并且CNA圖譜顯示，在缺氧核心區，染色體15p、14q和7p/q顯著缺失。個別樣本在多條染色體（8p、9p、13q、19q和21q）上也顯示出的丟失和擴增，這種變異最有可能由缺氧核心區域內的單個亞克隆造成，這證明了缺氧相關代謝是一種潛在的基因組不穩定性的驅動因素（圖4E）。
為了進一步驗證該發現，研究者分析了TCGA-GBM樣本（GBM IDH1/2野生型n=357），根據患者的缺氧基因表達評分對其進行分類（圖5A和5B）。缺氧驅動的腫瘤顯示染色體改變顯著增加，證實了代謝與基因組不穩定性之間的關系（圖5C和5D）。進一步實驗驗證，在常氧和缺氧條件下培養了原代患者來源的GBM細胞系2-6周（圖5E）。在慢性缺氧條件下CNA事件的顯著累積證實了應激誘導CNA變異的假設（圖4E）。此外，研究者通過分析常氧和缺氧條件下CpG位點cg12434587和cg12981137處的O-6甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）啟動子甲基化，研究了缺氧代謝對DNA甲基化的影響。在常氧條件下具有非甲基化MGMT啟動子的細胞系在缺氧條件下會發生高甲基化（圖5F）。
7.缺氧代謝調節GBM中的“go or grow”潛能
有文獻報道表明缺氧應激觸發細胞周期停滯，特別是S期停滯（圖6A）。根據研究模型，觀察到了缺氧代謝和細胞遷移之間的反向關系（圖6B、6C和6D）。總之，他們的發現為代謝變化和氧化應激是基因組多樣性的潛在相互驅動因素提供了證據，從而導致GBM的克隆進化。
當缺氧發生時，這種低氧誘導的糖酵解轉變會導致go programs的誘導，這有助于細胞逃逸/遷移到常氧區。由于在缺氧條件下，會發生S期停滯，隨后會導致從頭CNA的積累。作者假設這些受缺氧影響的細胞中有很大一部分會進入凋亡狀態，導致在GBM中看到的特征性壞死。只有一小部分細胞通過遷移相關轉錄模式的上調成功逃脫。除缺氧外，據報道，其他壓力源（如放射或化療）會導致GBM出現這種與壓力相關的擾動（圖6A）。
根據這個模型，可以看到低氧代謝和細胞遷移之間的反比關系。為了探索代謝改變區域中遷移基因表達特征的富集，研究者確定了特定基因表達特征的低富集和高富集之間的定向梯度的空間方向。每個點的方向向量是基于其局部鄰域中所研究的基因表達特征的分級富集。這些向量場計算使作者能夠近似空間基因表達軌跡，從而能夠識別空間上相反的轉錄途徑（圖6B）。基于這些矢量場計算，研究者報告缺氧響應和遷移特征顯示反向空間軌跡（圖6C和6D）。
8.探索Reactive Immune區域的腫瘤-宿主相互依賴性
研究者空間蛋白質組學分析發現，在Reactive Immune的區域中，髓系細胞和淋巴細胞顯著增加（圖7A、7B和7C）。為了研究Reactive Immune區域的腫瘤細胞分化，研究者通過將細胞細分為Radial Glia（EGFR+HOPX+）、Reactive Immune（EGFR+CHI3L1+VIM+）、Spatial OPC（EGFR+OLIG1+）、Neuronal Development（EGFR+SNAP25+CALM2+）和Reactive Hypoxia（EGFR+）。
研究者根據腫瘤細胞與淋巴或髓系細胞之間的距離量化了它們之間的細胞連通性，證實了腫瘤細胞與轉錄定義的Reactive Immune區域中的免疫區室之間增強的細胞相互作用（圖7D）。接下來，探討了不同（regions of interest）ROI中細胞類型的分布。研究者證實了在Reactive Immune和Reactive Hypoxia中有AC-like和MES-like細胞富集。OPC-like細胞主要富集于Neuronal Development中（圖7E和7F）。此外，Reactive Immune和Reactive Hypoxia區域均顯示腫瘤相關髓系細胞（TAM）和T細胞顯著富集（圖7G）。
鑒于T細胞在Reactive Immune和Reactive Hypoxia區域都富集，作者研究了T細胞（CD3+）上的平均PD-1蛋白水平，與Reactive Hypoxia和Neuronal Development相比，Reactive Immune區域內顯著增加，表明Reactive Immune中的局部免疫抑制增強。此外，GBM的scRNA-seq數據集證實了腫瘤Reactive Immune區域中記憶和耗竭T細胞的富集（圖7H）。
9.環境條件有助于雙向亞型轉變
通過之前建立的基于人體器官型新皮質組織的GBM模型來模擬了組織浸潤，該模型沒有代謝和免疫壓力。為了評估各種微環境的影響，研究者使用了不同年齡的人類組織和來自2周小鼠和2歲大鼠的組織（圖8A）。將組織培養4天，然后將類似MES-like原發性患者衍生細胞系接種到所有培養的組織切片中（圖8A）。培養7天后，消化組織，并使用FACS分離腫瘤細胞，進行scRNA-seq分析。使用inferred CNAs分析（圖8C和8D），基于腫瘤細胞在7號染色體中的特征性擴增對腫瘤細胞進行計算鑒定。
為了探索不同宿主環境的動態適應，所有惡性細胞都根據其相應細胞狀態進行富集（圖8E和8F）。基線狀態顯示出MES-1/2-like的表型，轉錄多樣性程度低但大多數處于細胞周期循環（圖8E）。在嚙齒動物神經環境中培養的GBM細胞表現出MES-1/2-like和AC-like轉錄特征的富集。為了探索動態適應，作者進行了RNA速率分析（圖8G）。
一般來說，從初始體外細胞培養（圖8G和8H）到MES-like和AC-like，表示由神經環境驅動的方向自適應。PTPRZ1是放射狀膠質細胞分化的GBM細胞的常見標記基因，基于其在MES-AC-hybrid狀態下的高速率相圖（圖8G、8H和8I），研究者的分析證實了OPC-like和NPC-like分支內的雙向命運。
四、總結
綜上所述，該工作在膠質母細胞瘤樣本中使用空間分辨多組學，并識別以免疫和代謝應激因子為特征的微環境。這些空間生態位受腫瘤微環境的影響，反映了對炎癥或代謝刺激的轉錄適應，并重現了神經發育階段。這篇文章有很多值得我們學習的地方，比如在實驗技術上，采用了許多先進的空間組學技術，空間轉錄組、空間代謝組以及空間蛋白質組；在機制上，聯合了體內和體外模型，逐步驗證潛在的機制。
