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說到今天的兩個配角：CRISPR基因編輯技術和single cell測序技術，那都是大家在近幾年科研界耳熟能詳的技術了。在如今的各個醫學領域，我們都能經常看到由這兩種技術主導而發表的CNS主刊，特別是CRISPR基因編輯技術還獲得了2020年諾貝爾化學獎。小編覺得未來說不定哪一年單細胞測序技術也可以獲得諾貝爾獎，讓我們拭目以待！
但是，Immugent今天要說的主角既不是CRISPR基因編輯技術也不是單細胞測序技術，而是它倆的王炸組合--Perturb-Seq技術。這項技術最初是由基因編輯大神張鋒和Paola Arlotta在2020年提出，相關文章發表在Science雜志上，這項技術可以同時研究活生物體中許多不同細胞類型中不同基因的功能，有關這篇文章的細節見本文第一個章節。
總的來說，通過基因組測序工作，科學家已經鑒定出大量基因，這些基因一旦發生突變，就會與人類疾病有關。傳統上，理解這些基因的作用需要對每個基因進行深入研究。通過開發用于體內應用的Perturb-Seq，我們可以開始以更有效的方式在動物模型中篩選所有這些基因，從而使我們能夠從機理上理解這些基因突變是如何導致疾病。廢話不多說，下面小編就通過4篇高分文章系統解讀一下Perturb-Seq技術的發展和使用。
1. Perturb-Seq的提出
Perturb-seq技術最初由來自Broad研究所的Xin Jin、Aviv Regev、張峰和Paola Arlotta在Science雜志發表的文章In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes中提出，他們研發出一種可以進行體內大規模遺傳功能研究的測序技術。
圖1：
在這項研究中，研究者首先利用CRISPR-Cas9在35個ASD/ND新發風險基因中引入移碼突變，隨后轉染進子宮內發育的小鼠大腦中，然后對出生后大腦中受到干擾的細胞進行單細胞RNA測序。測序分析從神經元和膠質細胞類中鑒定出細胞類型特異和進化保守的基因模塊。這些風險基因的擾動會影響到神經發育過程中反復出現的基因模塊和細胞類型，證明這些風險基因對關鍵細胞過程的影響。很多基因變異在不同的細胞或組織器官里往往能有不同的功能，但傳統的bulk RNAseq往往隱沒了這些基因在少數細胞的功能。因此，作者建立了活體內的Perturb-seq系統，它可以做到在一個發育胚胎中引入基因編輯來敲除疾病相關的基因，然后兩周后在發育后的腦細胞里進行單細胞測序。用這個高通量方法作者就一次性檢測了35個自閉癥相關基因，并且檢測他們在不同的腦細胞中的功能。
圖2：
最后，研究人員對現有的人類組織的的scRNA-seq和snRNA-seq數據（包含成人大腦皮質、ASD供體皮質和匹配對照組、胎兒人類皮質以及3個月、6個月大的人腦類器官）進行分析，發現14個基因模塊都在人類數據是保守存在的。其中8個模塊顯示出更多的模塊內相關性，而且相關性也隨著人類樣本的年齡而增加。隨后，作者進一步利用現有的數據集定義出ASD病人中不同類型細胞中差異表達的基因，并且在小鼠中發現了有1:1同源類似物的基因共14個。分析顯示中間神經元的SST和興奮性神經元的NRN1在ASD病人中表達降低，與Perturb-Seq試驗中表達顯著減少相一致。這表明Perturb-Seq技術可以準確的鑒定出人類ASD病人中存在的基因表達異常。
2. Perturb-seq用于癌癥編碼變體的大規模檢測
基因組測序研究已經確定了癌癥中數以百萬計的體細胞變異，但進一步的預測大多數變異表型所影響仍然具有挑戰性。以往區分有影響的變異體的實驗方法通常是使用表型檢測，這些方法報道了大量細胞群中預定義的基因特異性功能影響。鑒于此，美國羅德研究所的Jesse S. Boehm、Aviv Regev等研究人員，利用Perturb-seq對癌癥中的編碼變體進行了大規模并行檢測。相關研究作為Article在今年發表在Nature Biotechnology雜志上，篇名為：Massively parallel phenotyping of coding variants in cancer with Perturb-seq。
圖3：
為了評估癌基因相關變異的功能，研究者對基于sc-eVIP的Perturb-seq技術進行了優化，希望能實現通過外源性的引入DNA條碼的方式來標記癌基因中變體，從而可以在單細胞水平的下誘導不同的基因表達狀態。如果誘導的基因變體表達與野生型基因相似，則將該類別基因變體稱為野生類似型（WT-like），其他情況則認為該基因變體對其功能和表型存在影響。作者們克隆了每個基因變體編碼序列，然后加入不同的DNA條碼進行標記，對其單細胞水平上的影響進行評估。
圖4：
隨后，研究者又將Perturb-seq技術應用于對KRAS基因變體功能的評估中，對101個KRAS基因變體的功能進行檢測。首先，研究者證實了可以在A549肺癌細胞系中準確區分外源表達的KRAS，隨后就對大規模單細胞表達KRAS基因變體在癌細胞系中的表型進行評估。這些KRAS基因變體的表型可以分為野生類型、功能獲得型以及功能缺失型突變。功能獲得型突變類群變體所存在的位點主要落在KRAS基因的核苷酸結合結構域之中，另外有18個變體處于野生型類似型的基因變體類群之中，但是也會在腫瘤中出現。總之，Perturb-seq技術幫助構建了一種KRAS基因功能或者說表型的漸變狀態的衡量方式。
3. Perturb-seq繪制首個人類基因-表型綜合圖譜
自從單細胞測序技術被商業應用后，我們經常可以在各大雜志的文章中見到各式各樣的圖譜研究報道。這類文章通常以某一物種或者組織的大量測序數據為基礎，通過在單個細胞水平揭示研究對象的細胞亞群構成。Perturb-seq毫無疑問是更強大的，其可以更進一步的在單細胞水平檢測出CRISPR sgRNA擾動對基因轉錄影響的技術。因此，為了建立一個全面理解的細胞功能的圖譜，2022年6月9日，美國加州大學舊金山分校Jonathan S. Weissman研究組與紀念斯隆·凱特琳癌癥中心Thomas M. Norman研究組合作在Cell雜志上發表了題為Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq的研究。
圖5：
為了揭示基因擾動的功能后果和基因型-表型關系，研究人員使用人類血癌細胞系，以及來自視網膜的非癌細胞，對超過250萬個細胞進行了Perturb-seq，并使用這些數據構建了一個基因型-表型綜合圖譜。研究團隊根據基因的共同調控將其聚類到特定表達程序中，并計算每個擾動簇中每個基因表達程序的平均活性。分析結果包含多個與基因干擾相關的已知表達程序，包括蛋白酶體功能障礙導致的蛋白酶體亞基上調、 ESCRT蛋白缺失時NF-kB信號通路的激活，以及膽固醇生物合成上調對囊泡運輸缺陷的反應等。
圖6：
當前，醫學領域內一個關鍵的科學問題，就是如何理解細胞核和線粒體基因組的表達來應對線粒體壓力。在這項最新研究中，作者通過實驗設計為探究這一問題提供了可能。為了確定基因擾動引起的差異表達模式，研究者檢測了單細胞轉錄組測序數據在線粒體基因組中的分布。為了驗證這種基于位置的分析的有效性，首先證實了已知線粒體轉錄調控因子（TEFM）和RNA降解（PNPT1） 的敲除會導致線粒體基因組位置發生重大變化。相比之下，研究發現許多基因擾動似乎導致了mRNA相對豐度的變化，而不是位置排列的總體變化。鑒于觀察到的反應的復雜性，研究人員提出可能有多種機制影響不同線粒體編碼轉錄本的水平，以應對不同的壓力。
4. Perturb-seq揭示調控T細胞衰竭的關鍵基因
在腫瘤免疫領域的研究中，一個很關鍵的科學問題就是T細胞衰竭。在過去的幾十年里，研究人員都在從不同角度去探索這個令人頭大的科學問題。2022年6月23日，來自斯坦福大學的Ansuman T. Satpathy 團隊同樣是利用Perturb-seq技術在Cancer Cell 上發表題為Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence 的文章。作者通過構建CRISPR篩選體系，揭示了耗竭T細胞中表觀遺傳學相關染色體重塑和核小體組裝的基因是調節耗竭狀態的關鍵基因。
圖7：
這項研究的作者開發了一個T細胞衰竭模型，它可以用于研究培養皿中分離的免疫細胞的相關分子機制。眾所周知，不斷激活分離出來的T細胞受體可以很好地模擬腫瘤微環境中發生的生物過程。然后，研究人員使用CRISPR-Cas9基因編輯技術，在細胞中改變數以萬計的基因。他們測試了哪些T細胞在不斷激活受體后比平常表現出了更多或更少程度的衰竭。這一目的在于確定哪些基因在觸發T細胞衰竭中起著最至關重要的作用。
圖8：
研究人員在對調控T細胞衰竭的關鍵分子進行篩選中，觀察到其中Arid1a、Smarcc1 和 Smarcd2是三個最重要的基因，它們都是cBAF復合物的組成分子。特別是將Arid1a敲除后，可以顯著阻礙了cBAF復合物的形成，從而進一步提高體內T細胞的持久性和抗腫瘤免疫效力，作者隨后在人耗竭T細胞也驗證出Arid1a具有同樣的抗腫瘤潛力。此外，包括Arid1a在內的cBAF亞基的敲除可以通過限制AP-1轉錄因子對染色質的可及性來改善T細胞功能，從而抑制與衰竭相關的染色質狀態的獲得。進一步分析顯示cBAF 和 INO80 染色質重塑復合物在T細胞耗竭中具有不同的作用。cBAF主要調節效應和耗竭相關基因，而INO80主要調節代謝。這也表明協同靶向多種途徑可以改善T細胞功能。
5.小結
想當初，CRISPR基因編輯技術剛在實驗室進行應用時，就使我們具有研究任何一個基因的生物學功能的能力；而隨后的單細胞測序技術則是為我們提供了更加精細的、在單個細胞水平的視角，使我們不再會擔心因為混雜多種細胞而影響測序純度的問題。現如今，Perturb-seq技術的興起則是將這兩種革命性技術強強聯合，使我們可以在任何細胞上研究任何基因的調控機制。
科技進步之快已經遠遠超過我們的想象，無論是在工程領域還是醫學領域都為我們提供了操作空間。如果說上個世紀的醫學科研工作者還會因沒有實現精準的檢測技術限制當時的科學研究，現如今的醫學科技已經基本可以滿足我們各種需求，而且我們還可以基于各種需求創造技術。因此，未來醫學科研的研究方向不應該是以高新技術為主導，即使它們也很重要，但是更多的科學研究應該以解決重大科學問題為導向。
雖然，小編今天介紹的這個Perturb-seq技術是十分強大的，但是目前還都只是美國的一些大型實驗室在使用，未來幾年可能也會引入到國內。即便如此，對于一般的實驗室來說還是具有很大挑戰的，因為進行高質量的CRISPR建庫是非常難的。此外值得注意的是，Perturb-seq的數據說到底也是單細胞數據，因此，和其它公共數據一樣，我們可以挖掘它們的實驗數據來為我們自己的研究進行服務。
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