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單細胞測序技術的提出，為我們提供了一個更精細的，在單細胞細胞水平上的研究視野。但是值得注意的是傳統的單細胞測序技術，如通過制備細胞懸液的方式來獲得單個細胞，這個過程會破壞掉組織原始的空間結構，從而喪失了各種細胞在組織上的空間分布信息。而我們知道存在相互作用關系的細胞之間在空間上的分布具有聚集性，因此傳統的單細胞測序技術就丟失了各種細胞空間分布的重要信息。隨后，單細胞空間轉錄組測序技術的提出在一定程度上為我們提供了各種細胞在原始組織上的空間分布信息，但是由于技術的限制，目前單細胞空間轉錄組測序技術每一個spot上都是幾個甚至幾十個細胞的混合體。因此，基于目前的空間轉錄組測序技術，我們仍無法真正在空間組上做到單個細胞水平的測序。
今天小編就來介紹一種技術：PIC-seq（physically interacting cells），這種方法采用了溫和的組織解離手段，形成了能夠很好的保留組織中細胞結構的細胞聚集體。隨后，通過對物理接觸的細胞聚集體的分析，實現高分辨率的細胞間相互作用研究。總體上說，這種方法結合了單細胞和PIC復合物的scRNA-seq數據，將每個測序的PIC復合物以計算的方式反卷積為兩個或更多的單細胞。此外，PIC-seq通過比較PIC及參與的單個細胞來表征細胞間串擾下游的基因調控。
通過PIC-seq技術，研究者首先可以通過熒光激活細胞分選，從而分離出PIC。接著通過大規模平行RNA單細胞測序（MARS-seq）獲取多個相互作用細胞的組合RNA譜的信息。然后，通過計算反卷積算法推定復合物的細胞組成，及PIC和單細胞中轉錄狀態分布的比較模型，對PIC-seq數據進行分析。下面小編就通過兩篇有關PIC-seq技術的高分研究來系統介紹一下，如何巧妙的利用PIC-seq來開展我們自己的研究工作。
1. PIC-seq揭示存在物理相互作用的細胞之間的互作
第一項研究也是PIC-seq技術最先提出時發表在Nature Biotechnology上的一篇文章，篇名為：Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells。作者首先使用PIC-seq分選系統對兩種不同培養混合物進行了處理，但發現分選并不成功，雜散顆粒很少，且幾乎沒有PIC。于是乎還是之前一句老話，所謂技術不夠，算法來湊。為了實現混合粒子反卷積，作者開發了一種回歸策略，給每種混合物中相互作用的細胞類型賦予一個值（UMI, unique molecular identifier）。根據在每個譜系中觀察到的各細胞類型的特定信息，高精度地模擬推導估計混合因子。
該方法結合了單細胞和PIC復合物的scRNA-seq數據，將每個測序的PIC復合物以計算的方式反卷積為兩個或更多的單細胞。此外，PIC-seq通過比較PIC及參與的單個細胞來表征細胞間串擾下游的基因調控。作者還使用PIC-seq在體外和體內研究了T細胞與樹突狀細胞的相互作用，以表征相互作用特異性及其激活的基因表達程序。。
圖1：
作者首先在體外模型中驗證PIC-seq的可行性，將CD11c+ DCs（用LPS和抗原激活）和CD4+ T細胞（卵清蛋白特異性αβ-TCRs）進行不同時間的單獨培養和共培養（3 h，20 h，44 h）后，分別用PIC-seq進行測序。FACS分選共培養的T細胞-DC PICs，得到TCRβ和CD11c雙陽性的細胞占5.68 ± 0.53%。分析單一的T細胞或者DC細胞以及PICs的基因表達和細胞成分，結合單細胞模型數據和每個PICs的UMI分數，可推斷出每個PIC的最大可能組合，表明PIC-seq可用于相互作用細胞的分析。
2. PIC-seq揭示T細胞與DC的相互作用決定T細胞的活化及分化
隨后，研究者在野生型小鼠耳廓皮內注射熒光標記的巴西日圓線蟲（Nb）或磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。注射48 h后，獲得引流淋巴結的T細胞-抗原遞呈細胞（APC）PICs。通過流式細胞術分析，研究者發現TCR+ 和CD11c+ 細胞群占總群的0.31 ± 0.06%，并使用共聚焦顯微鏡來評估組織的離解和對PICs的分選效率。結果表明T細胞和APC存在高度異質性，因此，研究者通過轉錄本信息將其劃分為多個亞群。通過分析結果，作者發現，在PICs中富集了Treg和CD8記憶T細胞。與PBS對照組相比，注射了Nb的PICs中單核細胞數量增加。與體外共培養實驗結果相似，PICs間的差異表達高度依賴于T細胞和APCs的類型。
圖3：
研究者接下來通過對T細胞和髓系細胞進行PIC-seq發現，在引流淋巴結中無論是PBS對照組，還是注射Nb樣本，調節性T細胞（Treg）和髓系細胞之間的相互作用頻率很高。為了驗證Treg細胞與APCs相互作用的能力，研究者使用FACS和共聚焦顯微鏡來表征表達Foxp3熒光報告基因的轉基因小鼠PICs和單個細胞中的Treg頻率。結果表明，T細胞和DC 細胞的PICs中Treg比例（23.3%）高于單獨T細胞中的Treg比例（4.55%）。Nb樣本來源的T細胞-DC PICs特異性上調了趨化因子Ccl22和Ccl17，共刺激因子Cd40、Ebi3和Dll4基因，表明了注射Nb樣本來源的特異性細胞相互作用。因此，PIC-seq能夠表征細胞與細胞之間的相互作用，對于識別細胞-細胞相互作用信號分子的新靶點具有很大的潛力。
圖4：
總的來說，這項研究首次提出了一種基于細胞分選和測序的新方法——PIC-seq，它可以用于分析原本在物理上結合的多種細胞類型之間的相互作用，以確定相互作用的特異性和被這些相互作用激活的基因表達程序，有望應用于傳染病、腫瘤免疫和免疫治療等領域的研究。當然，PCI-seq還存在一些局限性，比如不同的解離方法對特定的相互作用對表現出偏好，所以不能捕獲在體內發生的全部相互作用。此外，PIC-seq算法要求相互作用的細胞在轉錄上不能太相似，才能成功地反卷積。因此，它不能直觀地應用于由相似或相同的細胞組成的雙重態的研究，有待未來進一步優化和解決。
3. PIC-seq用于揭示腫瘤微環境中復雜的細胞相互作用
腫瘤微環境不僅影響腫瘤的發生發展，而且和免疫治療應答密切相關。限于腫瘤微環境高度的異質性，和復雜的細胞作用關系，傳統的研究方法已無法準確揭示腫瘤微環境各細胞之間的相互作用。因此基于單細胞測序的各種相關技術，為我們提供一個嶄新的視野深入解析腫瘤微環境中的免疫學機制。
接下來要介紹的一篇研究是利用PIC-seq研究腫瘤微環境中存在的細胞相互作用，于今年發表在Nature cancer 雜志上，篇名為：The interaction of CD4+ helper T cells with dendritic cells shapes the tumor microenvironment and immune checkpoint blockade response。在這些研究中，作者通過PIC-seq對人非小細胞肺癌(NSCLC)進行分析，詳細描述了CD4+輔助T細胞與樹突狀細胞的相互作用，并且作者在體外和卵清蛋白特異性αβTCRCD4+T-t細胞模型中重建了它們的相互作用，發現了Tht程序由呈現腫瘤抗原的樹突狀細胞在腫瘤淋巴結中啟動，這些功能對于利用抗PD-1治療的抗腫瘤反應非常重要。
圖5：
為了清楚的揭示NSCLC的TME中髓系細胞和T細胞之間的相互作用，研究者將PIC-seq技術應用于早期NSCLC病變的臨床樣本中進行研究。研究者通過對早期未接受治療的手術切除的10例NSCLC組織，與鄰近未發生癌變的正常組織進行了PIC-seq測序，構建了NSCLC患者的PIC圖譜。隨后，研究者使用MetaCell算法將PIC-seq數據進行了整合，建立TME和健康組織中單細胞狀態的背景模型，同時根據基因表達將T細胞進行分類：遷移T細胞，幼稚T細胞，增殖T細胞，CD4+激活T細胞，CD4+記憶T細胞，CD8+T細胞，CD8+細胞毒性T和CD8+功能失調T細胞。緊接著，研究者同樣根據VCAN或CD31基因的表達情況將骨髓細胞分為單核細胞的兩個子集，并且將剩余的髓系細胞亞群分為四種樹突狀細胞亞型，即：表達DC的單核細胞基因、經典DCI型樹突狀細胞、經典DCII型細胞和富含免疫調節分子的成熟樹突狀細胞。
通過分析結果，研究者發現腫瘤組織和鄰近無腫瘤組織之間的細胞組成存在一致的差異，他們計算了每個標本的TME與健康細胞狀態的比率，并量化了子集豐度之間的相關性。結果與之前對NSCLC病變的的單細胞分析一致，因此這個結果可以作為研究TME中定義細胞相互作用的分子程序的基線。
圖6：
進一步的通過結合多重免疫熒光和其它技術，研究人員發現，表達CD4標記（cluster determinant 4），PD-1（程序性死亡配體1）和CXCL13（C-X-C基序趨化因子配體13）的T細胞，是NSCLC腫瘤微環境中形成與抗原呈遞樹突狀細胞相互作用的主要樞紐。隨后，作者將這群新發現的腫瘤特異性很高，且基因相同（克隆）保守的T細胞命名為輔助性腫瘤T細胞（Tht）細胞。此外，研究者發現在腫瘤微環境中Tht細胞比效應CD8+T 細胞更傾向于與樹突狀細胞發生相互作用。
4. T細胞與樹突狀細胞的相互作用決定免疫治療效果
為了更好地了解Tht細胞在體內的時空分布核分化動態，作者利用小鼠模型，將B16-OVA細胞移植到WTC57BL/6J受體中。隨后在腫瘤注射后10天和17天，對從腫瘤引流淋巴結(tdLNs)和頸部周圍淋巴結(cLNs)中分離的12154個陽性單TCRβ+T細胞進行MARS-seq測序。結果發現，抗原特異性的CD45.1+TCRβ+OT-II T細胞上調了從體外研究中衍生的Tht細胞特征、tdLNCD45.1+TCRβ+OT-IIT細胞上調了T細胞激活特征、體內Tht細胞特征與幼稚t細胞基因的表達減少相關，并與細胞周期基因的表達相關。
接下來，作者研究了Tht細胞的細胞動力學，及其從tdln向TME遷移過程的工作機制。研究者收集并分析了內源性TCRβ+ T細胞，并在第10和17天從TME過繼轉移OT-IICD45.1+ TCRβ+ T細胞，以及在腫瘤注射后第10天從tdLNs和clns的細胞。結果表明，與腫瘤浸潤的T細胞顯著上調Tht相關的激活程序。
圖7：
接下來，為了進一步研究Tht細胞的狀態是否和tdln中與DC的物理相互作用，特別是抗原提呈功能相關，在注射腫瘤細胞后的第10天，也就是Tht細胞在tdln中積累較多時，研究者從tdLNs和cln中分離3406個qc陽性cD11c+ 髓系細胞進行了MARS-seq，并使用MetaCell算法對它們進行分析。同時，為了更好地定義抗PD-1治療后Tht細胞的分子重編程，作者對腫瘤注射后17天內來自過繼轉移小鼠tdln的2867個多克隆TCRβ+和OT-IICD45.1+TCRβ+T細胞進行了MARS-seq。通過整合所有的分析結果，研究者證實Tht細胞直接參與了抗pd-1抗體的抗腫瘤療效，并揭示了mTht細胞在抗pd-1治療后的分子重編程功能機制。
圖8：
總的來說，這項研究首次利用PIC-seq技術揭示了人類NSCLC病灶中CD4+PD-1+CXCL13+ T細胞(Tht)與DC-LAMP+ mregDCs之間存在的相互作用。研究者首次發現Tht細胞在TME中優先與DC相互作用，而不是效應CD8+ T細胞。同時，通過進一步使用實驗小鼠模型，作者揭示了Tht細胞的分化、擴張和維持，與tdln和TME中的腫瘤抗原呈遞相關。PIC-seq在揭示細胞-細胞物理相互作用方面的無偏性為探索腫瘤免疫的復雜相互作用動力學提供了意想不到的效果。這項研究的數據表明，TME種至少存在兩種不同的T細胞群，CD8+效應/功能障礙T細胞和Tht細胞，它們通過克隆擴展重塑TME，對腫瘤抗原呈遞做出特異性反應。
然而，這項研究并沒有清楚的揭示Tht細胞在TME中與其他免疫細胞之間的結合作用，如Treg、效應T、髓系細胞和NK細胞。在未來的研究中，如果能全面揭示這些Tht細胞如何通過和其它免疫細胞之間的相互作用，從而促進或抑制腫瘤的免疫殺傷機制，特別是患者在免疫治療的過程中發生的相互作用，將會為我們更全面的認識腫瘤微環境的工作機制提供重要依據。
5.展望
細胞之間的通訊交流不僅是組織維持發育和穩態的基礎，也是很多疾病發生發展的本質，包括腫瘤。在每個器官組織的功能部位，細胞通過物理空間上的相互結合作用進行通訊，并交換代謝產物、配體-受體信號和形成細胞網絡。其中，免疫細胞參與了許多類型的物理相互作用，從而促進組織修復、吞噬作用和細胞死亡等生理過程。在免疫系統中，T細胞與抗原呈遞細胞的物理相互作用就是一個十分重要的范例。這種相互作用對于免疫系統區分自身和非自身的能力至關重要，當CD4+ T細胞與抗原呈遞細胞發生物理相互作用時，會在T細胞受體上形成一個免疫突觸和在MHC-II分子上呈現抗原。根據T細胞受體對所呈遞抗原的親和力和共刺激分子的存在，這種相互作用可以激活胞內信號傳導和基因表達，從而導致特定的免疫決定。
盡管我們一直都清楚物理上相互接觸的細胞簇是一個功能單元，它們之間的直接相互作用是影響很多疾病，特別是腫瘤發生發展的主要決定因素。但目前對于體內各種細胞與其它免疫細胞，尤其是T細胞核樹突狀細胞相互作用的轉錄調節和串擾的表征仍然很困難。共培養的體外測定法或顯微鏡技術與具有不變T細胞受體的轉基因小鼠模型相結合盡管有效，但在分辨率和背景方面有一定的限制。而單細胞RNA測序在組織解離的過程中會消除細胞結合物。因此，PIC-seq技術的提出就為我們提供了一種嶄新的手段直接研究在物理上存在相互作用的細胞之間的功能交流。基于這項革命性的技術，即使通過消化會破壞掉組織原有的空間結構，但我們仍然可以精準捕獲到本身存在物理作用的細胞簇。
不過需要注意的是，目前使用PIC-seq技術進行研究的文章主要都是由其開發者所在的以色列實驗室所發表的，所以目前小編推測這種技術還沒有得到推廣。但是小編相信這種技術在未來會被商業化推廣，或者會有類似的技術被開發出來。同時，基于這種技術的數據和相應軟件作者都已經公開，大家可以挖掘已經發表的PIC-seq數據來用于自己的研究中。
[參考文獻]
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