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小伙伴們大家好哇！今天小編給大家介紹的是今年7月發表在Cancer Discovery(IF=38.272)的一篇單細胞文章。作者通過單細胞轉錄組測序和T細胞受體(TCR)測序揭示了胰腺導管癌患者腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的發育軌跡，生信分析一看就會，重點在于作者的實驗設計及豐富的生物學知識！快來和小編一起看看吧！
一.研究背景
胰腺導管腺癌(PDAC)占所有確診胰腺癌的85%，5年生存率僅為9%，化療和手術仍然是主要的治療選擇。免疫治療是一種新的治療策略，在多種癌癥中實現了良好的臨床治療效果。由于癌癥患者對免疫治療的反應各不相同，了解與臨床反應相關的腫瘤微環境(TME)的潛在免疫狀況是很重要的。盡管存在反應性腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），但迄今為止PDAC對免疫療法缺乏反應，并且迫切需要改進治療方案。單細胞RNA測序(scRNA-seq)已成為一種強大的工具，通過在同一細胞中結合轉錄組譜和T細胞受體(TCR)庫，來研究復雜細胞群（如TIL）的異質性。作者之前的工作研究已表明，腫瘤反應性PDAC TIL體外擴增用于過繼細胞治療(ACT)的可行性。因此，作者在本篇文章通過使用scRNA-seq和TCR測序相結合的方法對PDAC患者新切除的腫瘤和癌旁的組織進行分析，從而描述PDAC TIL的特征，以期了解TIL在PDAC的細胞免疫治療中的應用。
二.主要結果
1.T細胞單細胞轉錄組數據的生成及分析
為了描述PDAC中的TIL亞狀態，作者對7個PDAC癌癥樣本和一個癌旁的胰腺樣本進行了單細胞RNA測序，重點關注了CD3+TIL（圖1A）。除此之外，作者還整合了另外的兩套PDAC單細胞數據集（MDA2數據集：26例PDAC，10例癌旁；PUMCH數據集：24例PDAC，11例正常）。整合后，共39694個T細胞，來自57個PDAC樣本和22個癌旁/正常樣本。經過聚類分群，共鑒定出5個CD4+TIL，7個CD8+TIL和一個周期性（cycling）T細胞亞群（圖1B）。
為了了解每個T細胞簇的生物學功能，作者研究了每個簇的高表達基因和特定的轉錄因子表達。如圖1C結果顯示，不同T細胞簇具有顯著不同的細胞編程狀態差異：由于FOXP3、IL2RA(CD25)、CTLA4和調節性T細胞（Treg）相關轉錄因子IKZF2和IKZF4的表達，CD4-FOXP3簇被歸類為Treg；CD8+TIL群體中，通過TRM轉錄因子ZNF683的表達、TRM相關基因XCL1和GNLY的表達以及KLF2的低表達，CD8-ZNF683集群似乎是一個TRM樣群體；此外，高表達效應細胞標記物GZMB和PRF1和轉錄因子TBX21，被鑒定為細胞毒性CD8+細胞狀態；其中一組CD4-CXCL13和CD8-CXCL13顯示轉錄因子RBPJ和趨化因子CXCL13的表達，被認為是功能失調T細胞表型；另一組CD4-CCR7和CD8-CCR7/IL7R，共同表達轉錄因子LEF1和TCF7，被定義為中心記憶T細胞表型（Tcm）。
在整個數據隊列中，不同T細胞的頻率也顯著不同（圖1D）。此外，為了確定細胞狀態是否為腫瘤組織特異的，作者在具有匹配腫瘤和癌旁組織樣本的10名患者子集中比較了細胞狀態組成，結果表明：CD4-FOXP3和CD4-CXCR4細胞狀態在腫瘤組織中比癌旁組織中富集，而CD8-CXCR6/IL7R和CD8-GZMB/PRF1細胞狀態在癌旁組織比腫瘤組織中富集（圖1E）。
2. 通過軌跡圖揭示TIL轉錄組狀態的轉變
由于T細胞具有極強的在不同功能和分化狀態之間轉換的能力，作者在此應用偽時序推斷來理解已識別的細胞狀態之間的關系。因為CD4+和 CD8+T細胞在胸腺內選擇之外沒有發育相關性，所以作者分別對這些主要亞群進行軌跡分析（圖2A、B）。對于CD8+TIL，推斷CD8-CCR7/IL7R TCM狀態和CD8-CXCR6/IL7R狀態在軌跡上相關；該軌跡也表明，CD8-GZMK可能是介于CD8-GZMB/PRF1細胞毒性細胞狀態和CD8-CXCL13潛在功能失調狀態之間的中間細胞狀態；此外，CD8-MX1細胞狀態與其他細胞狀態的關系似乎不明確，因為它們沒有發生在軌跡的一個分支上，這表明它們可能是一個單獨的狀態（圖2A）。作者還發現，除CD8-CXCR6/IL7R外，來自腫瘤和癌旁樣本的CD8+ TIL的貢獻是重疊的（圖2C）。從偽時間分析得出的相似性和近端狀態轉變可能表明，腫瘤外發現的TIL群體(CD8-CXCR6/IL7R)可能有轉變為腫瘤內的狀態(CD8-ZNF683)。
接下來作者對CD4+TIL也進行了相同的軌跡分析（圖2B）。結果顯示CD4-CXCR4細胞狀態與TCM簇相鄰，與CD8+TIL相比，由于CD4-TIL每個細胞狀態具有更高的細胞密度，所以CD4+TIL的細胞狀態轉變具有更高的可信度。與CD8-MX1類群相似，CD4-MX1簇與其他簇之間的關系尚不清楚，這可能是由于其樣本量較小。與CD8+ TIL不同，CD4+ TIL在腫瘤與癌旁之間具有同質性(圖2D)。
為了確定T細胞狀態在同一PDAC樣本中共發生的程度，作者以逐個患者的方式對所有腫瘤樣本的細胞狀態頻率進行了Spearman相關性分析，結果表明：如果患者的A類細胞比例較高，那么他們的B類細胞比例也會較高，高度相關的CD8-MX1和CD4-MX1細胞狀態的頻率之間存在顯著的相關性（圖2E）。雖然CD4和CD8的這種細胞狀態與其他細胞狀態表達的許多基因相同，但只有CD8-MX1與CD4-FOXP3顯著正相關，證實了這些MX1狀態是獨立的，但同時也證實了富含干擾素的TME可能是它們顯著相關的原因，干擾素會影響這些細胞狀態。CD8-CXCL13和CD4-CXCL13細胞狀態之間存在顯著相關，再加上CD8-CXCL13細胞狀態與周期性T細胞群體之間存在顯著相關，提示CXCL13細胞狀態可能是TIL的增殖群體，盡管可能存在功能障礙。幾種T細胞狀態也呈現出了反比關系：例如CD8/CD4 CXCL13群體與CD4+ CXCR4效應群體呈顯著負相關，提示T細胞功能異常的TME在某些效應群體中含量較低。
3. TCR克隆型分布顯示擴增的TIL克隆可以占據多種細胞狀態
為了進一步了解T細胞狀態的潛在功能以及它們之間的關系，作者對7個樣本（MDA1隊列）的同一細胞子集進行了單細胞TCR測序和轉錄組分析。通過量化MDA1數據集與更大數據集之間的基因重疊，進一步驗證了細胞狀態間的相似性（圖3A）。較小的MDA1隊列的UMAP圖提示了聚類的穩健性，在CD8+和CD4+TIL的UMAP圖中，原始細胞狀態標簽都保留了共定位（圖3B、C）。為了評估MDA1樣本集中采樣偏倚的可能性，作者分析了每個樣本中不同細胞狀態的比例（圖3D、E）。除了CD8-CXCL13細胞狀態主要來源于一個樣本外，其與細胞狀態均不受患者所主導。
因為在多個細胞狀態中發現的克隆型(這里稱為細胞狀態共享)可能表明這些狀態之間的過渡，于是作者分析來自同一個單細胞的TCR序列和轉錄組信息，以確定細胞狀態之間的關系。對CD8+TIL和CD4+TIL的細胞轉錄狀態及其克隆頻率的可視化顯示，大多數克隆在低頻率下檢測到，表明在腫瘤部位的增殖有限（圖4A、B）。Circos圖的每條線都代表一個T細胞克隆，其中Circos圖外圈灰色線的高度與攜帶該TCR的細胞數量成比例。圖4A中的CD8轉錄組狀態顯示，作者發現在CD8-GZMK細胞狀態(藍綠色)中，擴展的TIL克隆型(即在腫瘤組織中發現多個拷貝)具有高度的細胞狀態共享（圖4C）。對于CD8-GZMK細胞狀態，18/40個TIL克隆型也被分配到至少一種其他細胞狀態，例如CD8-GZMK和CD8-ZNF683共享的6個克隆型（圖4D）。
在CD4+ TIL中，作者只發現了非常有限的克隆性簇共享，這表明腫瘤增殖能力較弱（圖4B、E）。這對于CD4-FOXP3細胞狀態(紅色)尤為顯著，在偽時序圖(圖2B)中可以看到，它與軌跡的其余部分的連接非常弱。這種細胞狀態和其他CD4狀態之間缺乏TCR共享，進一步支持了這些細胞是先天的而不是誘導的Tregs的觀點。
4. 克隆擴增發生在CD8+ TIL細胞而非CD4細胞
為了量化每個簇內克隆擴增的程度，作者通過計算患者CD4+和CD8+TIL的Gini指數來測量克隆頻率的均勻性。作者發現在基尼系數中值接近1的情況下，CD8+ TIL簇在患者中顯示出比CD4+ TIL更高程度的寡克隆性，然而，作者利用Shannon多樣性指數(另一種同時考慮克隆均勻度和克隆型豐度的多樣性指標)時，作者觀察到CD8+ TIL的多樣性總體上低于CD4+ TIL（圖5A）。
當通過基于細胞狀態分析時，作者觀察到一個相似的模式，所有CD4+ TIL狀態表現出比大多數CD8+ TIL狀態更低的克隆性（圖5B）。CD8+TIL的高克隆性主要來自于CD8- GZMK、CD8- GZMB/PRF1和CD8- CXCL13細胞狀態；CD4+ TIL不一定是這樣，因為CD4細胞狀態(CD4-FOXP3)的寡克隆擴增幾乎是最高的。CD8- GZMK、CD8-ZNF683、CD8-GZMB/PRF1和CD8-CXCL13在TME中有最大比例的克隆擴增細胞，表明其克隆擴增很穩定。這與CD8-CXCR6/IL7R細胞狀態相反，其中僅有四分之三的克隆被檢測到一次（圖5C）。綜上所述，這些指標表明，盡管CD8+TIL群體與CD4+TIL具有相似的克隆型豐富度水平，但CD8+效應群體的克隆性更高，這表明有選擇性的TIL克隆參與了對腫瘤的免疫應答。
5. TIL轉錄組分析和TCR測序揭示了它們在體外繁殖后的命運
對于MDA1隊列，每個組織的一塊被用于離體TIL培養。然后將培養的TIL用于轉錄組和TCR單細胞測序（圖6A）。圖6B展示了分群情況，圖6C展示各個細胞分群的基因表達情況。
以細胞為基礎的癌癥免疫治療領域的一個主要目標是識別和選擇最佳的T細胞亞型，以提供最有效的過繼細胞治療。作者發現，無論其在組織中的初始轉錄組細胞狀態如何，TIL克隆型在多種生長細胞狀態下均被鑒定出來，其中大多數為培養產物中的G1-CD8-CD27亞型（圖6D）。盡管在任何最終生長的細胞狀態和特定的初始PDAC TIL群體之間缺乏聯系，但有跡象表明，組織中的某些TIL群體優先生長（圖6E、F）。來自CD8-GZMK、CD8-ZNF683和CD8-GZMB/PRF1細胞簇的T細胞克隆在體外優先擴增，而來自CD8-CXCL13細胞簇的T細胞克隆相對于其在組織中的初始頻率下降（圖6E）。CD4+ TIL表現出類似的模式，主要是CD4+效應細胞擴增，而Treg細胞不擴增（圖6F）。作者提出了一個PDAC TIL的組織關系和分化軌跡的模型，以及它們在體外培養的每個成分群體中無限制擴展的模型（圖7）。
到這里這篇文章就介紹完啦，總結一下：作者通過對PDAC患者的癌癥樣本和癌旁進行單細胞RNA測序和TCR測序，并將腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）分為CD8+和CD4+TIL分別推斷了其分化發育軌跡；通過TCR測序分別識別了在兩種TIL中的共享及獨有的克隆擴增。乍一看分析極其簡單，但是巧妙在作者在分析scRNA-seq數據時結合了公共數據，擴大了樣本量，使文章數據更加飽滿。更加值得一提的是，作者對自己的樣本不僅僅進行了測序，還預留了一部分組織進行了體外培養及測序分析，再體外培養印證作者的結果以及分析與患者體內細胞狀態的不同，緊扣過繼細胞治療的主題。全文生信分析并不難，大量的生物學知識使整個文章豐富飽滿，感興趣的小伙伴可以拜讀一下原文哦！
