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第八種可變剪切
可變剪切(Alternative Splicing，AS)是指從一個(gè)mRNA前體中通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)組合）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程?？勺兗艚釉谵D(zhuǎn)錄組的形成中起著至關(guān)重要的作用，并且該過(guò)程在癌癥中經(jīng)常發(fā)生改變。
常規(guī)的可變剪接大致可分為7種基本形式：
（1）可變受體位點(diǎn)(AA)；（2）可變供體位點(diǎn)(AD)；（3）可變啟動(dòng)子(AP)；（4）可變終止子(AT)；（5）內(nèi)含子保留(RI)；（6）外顯子跳躍(ES)；（7）外顯子保留(ME)[1]。
最近有研究者發(fā)現(xiàn)一種非常規(guī)的可變剪接形式 ：Exitron splicing (EIS) [外內(nèi)含子剪接]。EIS在蛋白質(zhì)編碼的外顯子中創(chuàng)建一個(gè)隱性?xún)?nèi)含子（稱(chēng)為exitron），以增加蛋白質(zhì)組的多樣性。exitron是隱性?xún)?nèi)含子，在一個(gè)被注釋的外顯子內(nèi)有兩個(gè)剪接位點(diǎn)；也就是說(shuō)，exitron是一個(gè)外顯子的內(nèi)部區(qū)域，同時(shí)具有蛋白質(zhì)編碼（外顯子）和剪接（內(nèi)含子）的潛力，有證據(jù)表明EIS在癌癥中發(fā)揮著重要作用。盡管在癌癥中可能有很大的影響，但exitron剪接在癌癥基因中的功能及其臨床相關(guān)性仍然未知。
今天解讀一下2021年三月份發(fā)表在《Molecular cell》(IF=19.328)上的一篇文章。該研究系統(tǒng)地檢測(cè)和描述了33種癌癥類(lèi)型中的外內(nèi)含子剪接事件。研究表明外內(nèi)含子剪接代表了除基因改變之外的另一種癌癥驅(qū)動(dòng)機(jī)制，并且外內(nèi)含子剪接衍生的新抗原負(fù)擔(dān)是預(yù)測(cè)癌癥免疫療法反應(yīng)的一個(gè)候選因素[2]。
文章摘要：
作者對(duì)來(lái)自9,599個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)錄組的33種癌癥的EIS進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)EIS影響了63%的人類(lèi)編碼基因，其中95%的事件是腫瘤特有的。研究發(fā)現(xiàn)EIS和其受影響基因的體細(xì)胞突變之間的相互排斥模式。在功能上，文章發(fā)現(xiàn)EIS改變了已知的和新的癌癥驅(qū)動(dòng)基因，導(dǎo)致功能的獲得或喪失，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。此外，EIS衍生的新表位與MHC I類(lèi)或II類(lèi)結(jié)合。對(duì)一個(gè)腎透明細(xì)胞癌隊(duì)列的臨床數(shù)據(jù)分析顯示，EIS衍生的新抗原負(fù)荷與檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)。
主要結(jié)果：
Exitron splicing事件在癌癥中的全局圖譜
作者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了33種癌癥類(lèi)型的9,599名患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)，以及670個(gè)匹配的正常樣本（圖1A）。研究者還開(kāi)發(fā)了一個(gè)生物信息學(xué)工具，ScanExitron，用于分析RNA-seq數(shù)據(jù)中的外內(nèi)含子檢測(cè)。ScanExitron根據(jù)剪接接頭和基因注釋來(lái)識(shí)別exitron，并通過(guò)一個(gè)剪接百分比（percent spliced out ，PSO）指標(biāo)來(lái)過(guò)濾出低可信度的候選者，該指標(biāo)衡量了特定exitron被剪接的轉(zhuǎn)錄本的百分比（圖1B）。
由于TCGA中的正常組織與腫瘤相鄰,而且只適用于一部分癌癥類(lèi)型，作者擴(kuò)大了數(shù)據(jù)來(lái)源，包括GTEx（v7）RNA-Seq數(shù)據(jù)，來(lái)自9,636個(gè)健康組織樣本，代表30個(gè)解剖部位的53種組織類(lèi)型（圖1A）。在所有的腫瘤樣本中，作者觀察到卵巢癌（OV）、食道癌（ESCA）、胃癌（STAD）和急性骨髓性白血病（LAML）比其他癌癥類(lèi)型具有更高的外內(nèi)含子剪接負(fù)擔(dān)(圖2A）。在八種癌癥類(lèi)型的薈萃分析中，作者觀察到腫瘤樣本的exitron剪接負(fù)荷明顯高于匹配的正常樣本（圖2B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，exitron剪接可能有助于癌癥表型的形成。之后，作者確定了16個(gè)exitron splicing事件，這些事件在多種癌癥中顯示出反復(fù)的失調(diào)（圖2C）。受這些不同剪接的exitron影響的基因顯著地富集在由COSMIC癌癥基因上。例如，腫瘤抑制基因FOXO4和SPEN都是由于發(fā)生了exitron splicing事件而改變了基因的轉(zhuǎn)錄抑制功能（圖2D）。
腫瘤特異性exitrons能識(shí)別新的癌癥驅(qū)動(dòng)基因
作者識(shí)別了主要在腫瘤樣本中剪接的exitrons，稱(chēng)之為腫瘤特定exitrons（tumor-specific exitrons，TSE）。 研究者對(duì)正常樣本（TCGA正常樣本和GTEx）與TCGA腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定TSEs：1）在GTEx樣本中沒(méi)有剪接，2）在不超過(guò)三個(gè)TCGA正常樣本中剪接。 結(jié)果，共有123,338個(gè)(95.3%) exitrons被認(rèn)定為T(mén)SE。 同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，與其他癌癥相比，OV、ESCA、STAD和LAML的TSE剪接事件的數(shù)量最高（圖3A）。作者實(shí)施了一種基于頻率的方法，以確定在每個(gè)腫瘤類(lèi)型中富含TSE剪接事件的基因，稱(chēng)為顯著外內(nèi)含子剪切基因（significantly exitron-spliced genes，SEGs）。根據(jù)其剪接頻率對(duì)SEGs進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)排名前35位的SEGs顯著富集于COSMIC癌癥基因普查中的基因（圖3B）。FET蛋白家族的成員TAF15，FUS和EWSR1在排名靠前的SEG中。并且這三個(gè)基因在腫瘤樣本中的外內(nèi)含子剪接是相互排斥的，意味著這些外內(nèi)含子剪接事件可能有類(lèi)似的功能影響（圖3C）。 此外，在FET蛋白中出現(xiàn)TSE改變的患者與無(wú)進(jìn)展生存期受損有關(guān)（圖3D），這表明FET家族基因中的外內(nèi)含子剪接可能在促進(jìn)癌癥進(jìn)展中發(fā)揮作用。
作者對(duì)SEGs進(jìn)行了組織特異性分析。 發(fā)現(xiàn)NEFH是前列腺癌的一個(gè)SEG（圖3B）。因此，作者在TCGA前列腺腺癌（PRAD）隊(duì)列中檢查了NEFH的表達(dá)。NEFH在正常樣本中的表達(dá)水平明顯高于前列腺腫瘤樣本。NEFH的表達(dá)與Gleason評(píng)分成反比，Gleason評(píng)分是一個(gè)從腫瘤組織學(xué)預(yù)測(cè)癌癥侵略性的評(píng)分系統(tǒng)（圖3E）。作者進(jìn)一步評(píng)估了NEFH在150個(gè)腫瘤和29個(gè)正常樣本中的表達(dá)，這些樣本來(lái)自MSKCC前列腺癌腫瘤基因組項(xiàng)目，該項(xiàng)目收集了基于陣列的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和綜合臨床信息。作者發(fā)現(xiàn)與局部的前列腺腫瘤和正常組織相比，NEFH在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中明顯下調(diào)（圖3F）。 此外，腫瘤中NEFH的低表達(dá)與生化復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（圖3G）。為了支持這一點(diǎn)，作者用兩個(gè)NEFH-陰性的前列腺癌細(xì)胞系C4-2和PC-3（圖3H）來(lái)驗(yàn)證NEFH的功能。 當(dāng)比較過(guò)量表達(dá)NEFH的前列腺癌細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞時(shí)，觀察到NEFH的異位表達(dá)抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3I）、集落形成（圖3J）和DNA復(fù)制（圖3K），但通過(guò)裂解PARP蛋白水平測(cè)量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖3H），證實(shí)了NEFH在前列腺癌中具有腫瘤抑制功能。
腫瘤特異性exitrons和體細(xì)胞突變之間的互斥性
顯著突變的基因（SMGs），如TP53、PIK3CA和KRAS，以及SEGs，如TAF15、RRBP1和NEFH被分成兩組（圖4A），這表明 SMGs和SEGs是相互排斥的。研究者把重點(diǎn)放在PRAD隊(duì)列上，發(fā)現(xiàn)NEFH是排名最高的SEG，但沒(méi)有顯示突變（圖4B）。值得注意的是，當(dāng)關(guān)注PRAD隊(duì)列中顯示體細(xì)胞突變和外內(nèi)含子剪接的基因時(shí)，突變和外內(nèi)含子剪接之間的相互排斥模式在疾病樣本層面上是明顯的（圖4B）。在研究外內(nèi)含子剪接對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)外內(nèi)含子聚集在叉頭DNA結(jié)合域（FKHD）（圖4C）。將突變和外內(nèi)含子映射到FKHD的三維晶體結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)外內(nèi)含子剪接的改變很大程度上影響了non-Wing 2區(qū)域（圖4D）。當(dāng)檢查所有的TSE TCGA腫瘤時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)有明顯的重疊，并且在受外內(nèi)含子剪接和體細(xì)胞突變影響的蛋白家族（Pfam）領(lǐng)域有強(qiáng)烈的相關(guān)性（圖4E），表明外內(nèi)含子剪接影響蛋白功能的方式與基因改變類(lèi)似。
作者將基于單基因的SEG分析到基于多基因的分析，以測(cè)試TSE剪接事件是否在主要生物過(guò)程的基因組中顯著富集。利用MSigDB對(duì)特定腫瘤類(lèi)型中的每個(gè)基因組進(jìn)行了基于多基因的分析。確定了20個(gè)基因組在不同的腫瘤類(lèi)型中因TSE剪接而發(fā)生明顯改變（圖5）。
腫瘤特異性exitrons是新表位的來(lái)源之一
為了研究TSE slicing是否有可能產(chǎn)生免疫原性的新抗原。作者應(yīng)用ScanNeo來(lái)預(yù)測(cè)TCGA腫瘤中潛在的TSE新抗原。 對(duì)于總共123,338個(gè)獨(dú)特的TSE剪接事件，作者確定了168,206個(gè)推測(cè)的新抗原，每個(gè)TSE剪接事件平均有1.4個(gè)新抗原。在所有的腫瘤類(lèi)型中，發(fā)現(xiàn)OV的TSE新抗原的負(fù)擔(dān)最高。作者使用MS-GF+搜索了32個(gè)OV和35個(gè)乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）樣本的質(zhì)譜（MS）數(shù)據(jù)，這些樣本來(lái)自臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC）項(xiàng)目。發(fā)現(xiàn)28個(gè)來(lái)自TSE拼接的新表位。 與nsSNVs和indels相比，TSE拼接在OV中每個(gè)樣本引入的CPTAC確認(rèn)的新抗原數(shù)量較多，但在BRCA中數(shù)量較少（圖6A），這可能反映了兩種癌癥類(lèi)型之間TSE拼接和突變引起的新抗原負(fù)擔(dān)的差異。基于MS的免疫肽組分析證實(shí)了預(yù)測(cè)的新表位MKANPALTMVSSSPTRL（圖6B）。接下來(lái)，作者計(jì)算了TSE新抗原負(fù)荷與TCGA腫瘤免疫細(xì)胞組分之間的相關(guān)性，以評(píng)估TSE新抗原負(fù)荷與免疫應(yīng)答之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在多種癌癥類(lèi)型中，TSE新抗原負(fù)荷與較高的CD8+ T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和CD4+記憶T細(xì)胞含量呈正相關(guān)(圖6C)。作者還發(fā)現(xiàn)在ccRCC中TSE新抗原負(fù)荷與ICB臨床獲益之間存在顯著相關(guān)性 (圖6 D)。作者還觀察到OV和腎透明細(xì)胞癌(KIRC)是兩種最高的癌癥類(lèi)型，TSE新抗原載量高的患者表達(dá)的這些免疫原性基因標(biāo)記物水平較高(圖6E)。研究表明，具有高TSE新抗原負(fù)荷的卵巢腫瘤可能受益于ICB治療。
總結(jié)：
這項(xiàng)工作通過(guò)大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組分析構(gòu)建了一個(gè)癌癥exitron剪接景觀。研究主要發(fā)現(xiàn)外內(nèi)含子剪接破壞了功能性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致癌癥驅(qū)動(dòng)效應(yīng)。通過(guò)免疫肽組分析確定了外內(nèi)含子剪接衍生的新抗原。外內(nèi)含子剪接的新抗原負(fù)荷預(yù)測(cè)對(duì)檢查點(diǎn)抑制劑治療有更好的反應(yīng)。相較于傳統(tǒng)的七種可變剪接方式，外內(nèi)含子剪接作為第八種剪接方式對(duì)于新抗原的預(yù)測(cè)和研究提供了新的思路。此外，泛癌中的外內(nèi)含子剪切研究思路同樣適用于單一癌型的研究，例如最近發(fā)表的名為“Landscape of exitrons in gastric cancer”的文章[3]。這篇文章刻畫(huà)了胃癌中exitrons的特征。包括exitrons的互斥性可以協(xié)同致癌，剪切調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中剪切因子靶向了異常的外內(nèi)含子剪切，外內(nèi)含子來(lái)源的新抗原肽在胃癌中表達(dá)。這一系列文章足以證明exitrons在癌癥中有很大的研究空間。
參考文章：
[1] Zong Z, Li H, Yi C, Ying H, Zhu Z, Wang H. Genome-Wide Profiling of Prognostic Alternative Splicing Signature in Colorectal Cancer. Front Oncol. 2018 Nov 20;8:537. doi: 10.3389/fonc.2018.00537. PMID: 30524964; PMCID: PMC6262947.
[2] Wang TY, Liu Q, Ren Y, Alam SK, Wang L, Zhu Z, Hoeppner LH, Dehm SM, Cao Q, Yang R. A pan-cancer transcriptome analysis of exitron splicing identifies novel cancer driver genes and neoepitopes. Mol Cell. 2021 May 20;81(10):2246-2260.e12. doi: 10.1016/j.molcel.2021.03.028. Epub 2021 Apr 15. PMID: 33861991; PMCID: PMC8141048.
[3] Zhang Y, Ye G, Yang Q, Zheng B, Zhang G, Hu Y, Yu J, Li G. Landscape of exitrons in gastric cancer. EBioMedicine. 2022 Sep 19;84:104272. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104272. Epub ahead of print. PMID: 36137412; PMCID: PMC9494173
