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IF=38+的高質量單細胞分析文章
今天給大家分享一篇2022年9月13日發表在《Cancer Discovery》（IF:38.272）的單細胞分析。文章整體描繪了早期肺腺癌中B淋巴細胞的單細胞免疫組學景觀，將浸潤B細胞特征與主要的臨床病理特征相關聯，包括吸煙、驅動基因突變和腫瘤分期，并評估其臨床意義，如患者的生存率和對免疫療法的反應。是一篇非常值得學習的范文！
摘要：
腫瘤浸潤性B細胞和漿細胞（TIBs）在肺腺癌（LUAD）中很普遍，然而它們的特征不明顯。作者對16個早期LUADs和47個多區域正常組織進行了配對的單細胞RNA測序和B細胞受體測序（paired single-cell RNA and B cell receptor (BCR) sequencing ）。通過對約50,000個TIBs的綜合分析，確定了LUAD和鄰近正常生態系統中的12個TIB子集，并證明了LUAD中TIBs的廣泛重塑。記憶B細胞和漿細胞（PC）在腫瘤組織中高度富集，具有更多的分化狀態，體細胞超突變的頻率增加。吸煙者表現出明顯升高的PC，并有不同的分化軌跡。BCR克隆型的多樣性增加，但在LUADs和吸煙者中，隨著病理階段的增加，克隆性下降。TIBs大多定位于CXCL13+淋巴細胞聚集區，產生CXCL13的免疫細胞來源隨著LUAD的進展而演變，包括CD4調節性T細胞的升高部分。這項研究提供了早期LUAD中TIBs的空間景觀。
背景：
肺腺癌（LUAD）是最常被診斷的肺癌組織學亞型，并占了大多數與吸煙有關的癌癥死亡。因此，迫切需要在LUAD的早期階段進行治療的策略。由于對LUAD發病過程中腫瘤微環境（TME）的早期變化的認識滯后，這種進展受到了嚴重的限制。
在了解肺癌免疫生物學的努力中，T細胞一直是關注的焦點。其他細胞類型，特別是腫瘤浸潤性B細胞和漿細胞（TIBs），大多被忽視，它們在實體瘤（如LUAD）發病機制中的作用仍然不為人知。TIBs已經在不同類型的實體瘤中被發現。最近的研究表明，TIBs可以強烈影響患者對抗癌化療和免疫療法的反應，以及包括黑色素瘤和肺癌在內的各種癌癥的臨床結果。在最近的單細胞研究中也發現了TIBs，但它們的表型和狀態沒有得到廣泛的描述。可能是這些重要的研究由于測序的B細胞數量不足而缺乏對TIBs進行深入分析的能力。作者最近對5名早期LUADs患者的上皮細胞和TME細胞進行了分析，發現LUADs中的TIBs部分，包括B細胞和漿細胞（PC），相對于其匹配的正常肺組織而言有極大的增加，從而表明TIBs在LUAD發病機制中的潛在作用。
為了更好地了解TIBs在早期LUAD發病機制中的情況，作者對16個LUADs和47個匹配的來自早期疾病患者的多區域正常肺組織進行了配對的單細胞RNA測序和B細胞受體測序。研究了約7.3萬個細胞的BCR和約5萬個細胞的轉錄組，這是迄今為止關于TIBs最大的單細胞數據集。探索它們的轉錄狀態、分化和成熟狀態、空間特征、克隆型特性，以及細胞的相互作用和與其他TME細胞群的共定位模式。作者還將TIB特征與主要的臨床病理特征相關聯，包括吸煙、驅動基因突變和腫瘤分期，并評估其臨床意義，如患者的生存率和對免疫療法的反應。這項研究提供了對LUAD早期發展中TIB的普遍性質和功能表型的詳細了解。
結果：
LUADs和匹配的多區域正常肺組織中TIBs的單細胞分析
作者對來自16個早期LUADs和47個匹配的多區域正常肺組織的細胞進行了整合的scRNA-seq和scBCR-seq，這些細胞與腫瘤的空間距離不同（即鄰近的，離腫瘤邊緣0.5厘米；中間的，離腫瘤邊緣3-5厘米；遠處的，肺葉的外圍）（圖1A）。與其匹配的正常肺組織相比，LUADs中EPCAM-negative（TME）細胞的B系亞群分數明顯富集（圖1B）。為了驗證這一發現并進一步檢查TIB的空間分布，作者對16名患者中的5名患者的20個可用組織進行了多重熒光（mIF）。在所有患者的腫瘤樣本中都檢測到了淋巴細胞聚集（LAs），包括腫瘤區和基質（圖1C），以及2名患者的非腫瘤基質區。一致的是，與相匹配的正常組織相比，腫瘤中B細胞的總強度明顯較高（圖1D）。
作者試圖定義TIBs的各種轉錄狀態和BCR同型抗原。共有49,062個具有scRNA-seq數據的B系細胞被保留下來進行后續分析。無監督聚類顯示了12個不同的細胞集群（圖1E-F）。七個PC群的特點是免疫球蛋白同種型基因的主要類別和亞類別的不同表達（圖1E）。PB集群的細胞是CD38 + CD138 + IgD - CD27 +，與PC相比，它們顯示出相對較高的MHC II類基因的表達，以及MKI67和其他細胞周期相關基因的最高表達（圖1F）。總的來說，scBCR-seq檢測到的抗體同型與scRNA-seq推斷的抗體同型很一致（圖1E，右上角）。具體來說，幼稚型B細胞集群以IgM和IgD同型為主，記憶型B細胞集群顯示出各種不同的同型，而PC集群顯示出其相應的IgH同型的高度富集（圖1E，G）。與PC一樣，PB集群也是以IgA1/2和IgG1/2同型為主（圖1G）。
LUADs中TIBs明顯增加，而pc尤其在吸煙者中高度豐富
作者檢查了LUADs和匹配的正常肺組織中B系細胞的豐度和細胞組成（圖1H）。幼稚B細胞在全部B系細胞中的相對比例隨著與腫瘤的距離增加而明顯下降。相反，LUADs中記憶B細胞和PC的比例明顯升高（圖1I），后者在吸煙者中相對于非吸煙者尤為突出。接下來將TIB的特征與基因組數據相結合，包括腫瘤突變負擔（TMB）和驅動突變。作者發現與KRAS突變型或KRAS/EGFR雙野生型LUADs相比，EGFR突變型LUADs的PC比例明顯較低，幼稚型和記憶型B細胞的比例較高（圖1J-K）。
接下來，作者在獨立的患者隊列中驗證觀察到的結果，首先分析了Kim N et al.的大型公共scRNA-seq數據集，其中包括原發性LUADs、淋巴結和腦轉移，以及從44名LUAD患者獲得的正常肺部和淋巴結組織。與本文的隊列一致，原發性LUADs中記憶B細胞和PC的比例明顯增加（圖2A）。作者還分析了Leader et al.的30個早期LUADs組成的scRNA-seq隊列。作者同樣發現吸煙者與非吸煙者相比，PC的比例明顯增加（圖2B）。作者還使用CIBERSORTx對來自TCGA-LUAD隊列的大量RNA-seq數據進行了免疫反卷積分析。結果發現PC的比例在吸煙者與非吸煙者的LUADs中明顯增加（圖2C，左）。值得注意的是，與相匹配的正常肺組織相比，吸煙者而非非吸煙者的LUADs中PC的比例明顯增加，而且戒煙15年的現吸煙者或戒煙15年以上的吸煙者的變化幅度更大（圖2C，右）。這些觀察結果表明PC在LUAD的免疫病理學中的潛在作用，特別是在吸煙者中。
LUADs中的高PC特征預示著更好的生存和對免疫療法的反應
為了評估TIB的臨床意義，作者利用scRNA-seq數據構建了主要TIB亞群的細胞類型特異性基因簽名，并在去卷積分析中證實了其可靠性。作者還分析了TCGA-LUAD隊列的大量表達數據，發現PC簽名得分隨著病理階段的深入而逐漸下降（圖2D）。Cox比例風險模型和Kaplan-Meier模型都顯示，相對較高的PC特征分數與較好的總生存期（OS）明顯相關（圖2E-F）。在評估的22個免疫細胞亞群中，作者發現PC特征與TCGA-LUAD隊列中較好的OS有明顯的關聯。
作者通過分析4個已報道的臨床試驗的公共數據集來評估PC特征與患者對免疫療法反應的相關性。分析顯示，治療前腫瘤中相對較高的PC特征與抗PD-1治療的更好反應、持久的臨床獲益（DCB）和明顯更好的無進展生存（PFS）有關（圖2G）。同樣，對POPLAR和OAK這兩項使用atezolizumab進行PD-L1阻斷的試驗的大型LUAD隊列（n = 316名患者）的分析顯示了非常一致的結果。相對較高的PC特征表達與抗PD-L1治療的更好反應和改善的OS（圖2H-I）明顯相關。
高分化PC在LUADs和吸煙者的long-lived PC中富集
作者接下來對PC的分化狀態進行深入分析。首先，用Monocle 3重建了PC的發育軌跡，偽時間分析顯示了PC分化的各種不同狀態，包括long-lived PCs, short-lived PCs和PB（圖3A）。long-lived PCs的特點是STAT3、IKZF3（Aiolos）和CD37的高表達（圖3B）。IgA/IgG轉錄物的表達水平也較高（圖3B）。此外，為了支持他們的抗體分泌功能，大多數long-lived PCs失去了膜Ig變量（IgV）基因和BCR的表達（圖3C，左）。由CytoTRACE推斷的細胞分化狀態與Monocle 3的結果一致（圖3A），觀察到隨著偽時間的進展，CytoTRACE的分數逐漸下降，即分化程度增加（圖3C，中間）。有趣的是，在吸煙者與非吸煙者的LUADs中，完全分化的、長壽的PC明顯富集（圖3C，右）。
當按抗體亞類調查PC時，IgM/IgD + PC的分化程度最低，其次是IgG3 +、IgG1 +、IgA1 +、IgG2 +，最后是IgA2 + PC，它們的得分最低（即分化程度最高）（圖3D）。相對于來自正常肺組織的PC，LUADs的PC分化程度明顯更高（圖3E）。與基于CytoTRACE的分化推斷一致，作者注意到LUAD PC中表達的基因數量相對于正常肺組織的基因數量明顯較低。
LUADs中的記憶B細胞更頻繁地進行類別轉換并處于late-GC階段
記憶B細胞是在生殖中心（GC）反應期間產生的，與PC分化平行（圖3F，頂部），其分化在轉錄水平上受到嚴格控制。作者觀察到腫瘤組織的記憶B細胞中IgA/IgG基因的表達量急劇增加（圖3F，底部），表明LUADs中的記憶B細胞主要是類別轉換和處于GC后期階段。為了進一步研究LUADs中記憶B細胞的成熟狀態和轉錄異質性，作者根據其IgA/IgG基因的表達，定義了三個發育階段早期、中期和晚期GC階段，然后進行CytoTRACE細胞分化分析。一致的是，與早期GC階段的記憶B細胞相比，晚期GC階段的細胞可能分化程度更高，表現為CytoTRACE得分明顯較低（圖3G）。此外，軌跡早期的記憶B細胞大多是CD27-，未轉換，具有最低的BCR特征分數，并且大多來自正常的肺組織，而軌跡晚期的細胞是CD27+，轉換，具有最高的BCR特征分數，并且幾乎只來自腫瘤組織（圖3H-I）。
沿著軌跡對前3000個可變基因的表達動態分析顯示了與記憶性B細胞分化有關的不同生物過程（圖3J）。作者還發現相對于早期記憶B細胞，晚期上調的基因（如XBP1、MZB1和JCHAIN）和下調的基因（如CXCR5、CCR7、CD69和BACH2），與之前報道的這些基因在B細胞分化中的作用一致（圖3K），意味著LUADs中的記憶B細胞可能是在分化軌跡的晚期階段產生。IgA1 +和IgG1 +細胞是scBCR-seq顯示的最豐富的類別轉換亞群（圖3L，頂部），這一觀察在TCGA-LUAD大型隊列中得到證實（圖3L，底部）。此外，還觀察到IgM + /IgD +細胞的比例逐漸減少，IgA +細胞的比例增加，與LUADs的距離越來越近，因此，腫瘤組織中轉換型與非轉換型的比例明顯增加（圖3M）。結果表明，具有不同分化狀態的B細胞和PC在肺部表現出不同的轉錄和表型特征，以及地理空間的異質性（圖3I和3N）。
在LUADs、吸煙者中，BCR克隆型的多樣性較高，克隆性較低，并且隨著病理階段的增加而增加。
為了更好地了解LUADs和鄰近組織的免疫球蛋白重現，作者分析了在同一cDNA文庫上產生的配對scBCR-seq數據，并確定了72,949個具有生產性VDJ重排的細胞。作者觀察到腫瘤組織中獨特的BCR克隆型的數量明顯增加，即其BCR重排的多樣性更高（圖4A）。我們檢測到腫瘤組織中擴大的BCR克隆型的數量增加，但克隆頻率相對較低，即BCR復合物的克隆大小分布的不均勻性低于正常組織，在正常組織中少數擴大的克隆在復合物中占主導地位（圖4B，左）。同樣，還觀察到吸煙者與非吸煙者相比，BCR克隆的不均勻性較低（圖4B，中），而且隨著病理階段的增加，BCR克隆的不均勻性也在增加（圖4B，右）。
作者測量了來自一個特定地理空間位置（如LUAD）的樣本中的BCR組合與來自另一個位置（如遠處的正常肺）的BCR組合的重疊情況。來自正常肺組織的BCR克隆型有38.9%與來自LUADs的BCR克隆型是共享的，相反，來自LUADs的BCR克隆型基本上是獨特的，與鄰近組織共享的克隆比例低得多（6.6%）（圖4C）。值得注意的是，當根據LUADs中檢測到的BCR克隆型是否為腫瘤所獨有時，作者觀察到與正常組織共享的BCR克隆型是高度擴展的，與之相反，腫瘤獨有的克隆型擴展較少，主要由小克隆和單克隆組成，特別是在吸煙者中（圖4D）。
腫瘤中Ig類別轉換、VDJ基因使用和expanded PCs的不同情況
在這一部分，作者按照Ig亞類（即IgG3、IgG1、IgA1、IgG2、IgG4和IgA2）編碼基因的基因組坐標（5’至3’）。結果表明LUADs的B細胞可能經歷了獨特的V(D)J重排。最后，通過整合scRNA-seq和scBCR-seq數據，發現大多數擴增克隆的細胞是PC（圖4F）。擴增最多的前15個克隆幾乎都被映射到PC的集群中（圖4G）。
LUADs中BCR體細胞高突變（SHM）的地理空間特征
GCs中B細胞的親和力成熟是反復幾輪克隆擴增加上體細胞超突變（SHM）的結果，然后是基于親和力的抗原特異性B細胞選擇（圖4H，左）。通常情況下，高的SHM頻率表明有很強的抗原特異性親和力。作者使用scBCR-seq數據量化了SHM水平，并在此基礎上將細胞分為4組：非（無SHM）、低（突變頻率3%）和高SHM（>3%）。作者觀察到幼稚B細胞的BCR中沒有SHM，記憶B細胞的BCR中有低或中等水平的SHM，而PC的BCR中有高水平的SHM（圖4H，右；4I）。具有高SHM頻率的細胞的克隆型大小相對較大（圖4J）。罕見的IgD + PC亞群表現出最高的SHM頻率（圖4I），與IgD + B細胞在超級抗原驅動的GC反應中發展的假說一致。作者還觀察到SHM頻率隨著與腫瘤的距離增加而逐漸增加，并且在切換和未切換的細胞中都是如此（圖4K-L）。
B細胞趨化性CXCL13-CXCR5軸在早期LUAD發展中的作用
為了了解LUADs中TIBs的招募，作者檢查了已知的B細胞吸引劑的表達，包括CXCL13，這對B細胞招募和三級淋巴結構（TLSs）的形成至關重要（圖5A），以及其他趨化因子及其受體，包括CCR7-CCL19/CCL21，CXCR4-CXCL12，CXCR3-CXCL9/10/11，以及CCR6-CCL20。其中，CXCL13-CXCR5趨化因子軸似乎在早期LUADs中占優勢。在LUADs中，TME細胞中的CXCL13+T細胞和CXCR5+B細胞都高度富集（圖5B），并且在TCGA-LUAD隊列中，CXCL13的表達也高于正常肺組織。
作者使用nanoString GeoMx digital spatial profiler (DSP) 平臺對4個LUADs和配對的正常肺組織中的CXCL13蛋白（BCA1抗體）表達，并且定義T細胞（CD3）、B細胞（CD20）和腫瘤區間（泛細胞角蛋白）的線型標記物進行了表征。根據形態學標志物的表達，B細胞、T細胞或腫瘤細胞富集（圖5C）。在正常肺或T/LA-/BCA-的ROI中沒有或很少觀察到B細胞。LA/BCA1+ROI中的B細胞數量明顯增加（圖5D）。為了更全面地了解LA的空間分布，作者使用Visium平臺（10X Genomics）對scRNA-seq隊列中兩個病人的4個樣本進一步進行了空間轉錄組學（ST）。雖然T細胞總體上是CXCL13產生的主要來源，但單細胞分析表明，大多數CXCL13+細胞是CD4 Tfh和CD8衰竭T細胞（Tex），其次是CD4調節性T細胞（Treg）和增殖性Tregs，而只有非常小的CD8效應T（Teff）細胞和CD8常駐記憶T（Trem）細胞的亞群表達CXCL13（圖5E）。
然后，作者研究了LUADs中CXCL13生產的細胞來源是否隨著疾病的發展和進展而演變。在這個隊列和另外3個公共scRNA- seq數據集中，觀察到LUADs與正常肺組織中Tregs的CXCL13+細胞的相對比例明顯增加（圖5F）。在TCGA--LUAD隊列中也發現了CXCL13的表達增加，并注意到CXCL13的水平從正常肺到非典型腺瘤性增生（AAH），即LUAD最早的前體病變，直至浸潤性LUAD（圖5G，左）。一致的是，B細胞和PC特征分數也沿著這個病理譜系逐漸增加（圖5G，中間和右邊）。
免疫調節基因的表達和TIB表型的異質性
作者確定了有CXCL13表達和無CXCL13表達的腫瘤相關LA（分別為LA/BCA+和LA/BCA-）之間B細胞區間的免疫生物標志物表達的差異。相對于LA/BCA-ROIs，LA/BCA+ROIs的B細胞區塊顯示CD27、CD40的表達明顯增加，CTLA-4、LAG3以及PD-L1的表達減少。此外，作者探究了TME內各種細胞群產生的細胞因子如何調節B細胞的類別轉換重組（CSR）和PC的產生。然后作者量化了免疫和基質細胞亞群中誘導IgG（IFN- ，TNF）和IgA（TGF- ，IL-6和IL-10）CSR的細胞因子的表達水平（圖5H）。作者將分析集中在TGFB1上，已知它在促進人類B細胞的IgA同種型轉換中至關重要。雖然TGFB1被各種細胞類型廣泛表達，但值得注意的是，相對于匹配的正常肺組織，TGFB1在本文的隊列（圖5I）和Kim等人的數據集中LUADs的癌相關成纖維細胞（CAFs）中明顯更高。此外，作者利用Visium的數據進行了TGFB1表達細胞的空間映射，觀察到TGFB1的強烈表達，特別是在富含成纖維細胞的空間區域，如成纖維細胞的典型標志物的高表達（圖5J）。這些結果表明，CAFs中TGFB1的上調可能與LUADs中IgA+PC的比例增加有關。
記憶B細胞和IgA+ PC與CD4 Tregs和CD8 Tex強烈共存，與細胞毒性T細胞呈負相關
為了更好地了解各種TIB亞群如何影響TME的功能表型，作者首先測量了TIB亞群中免疫調節基因的表達。作者進一步檢查了細胞狀態與其他28個免疫和基質細胞亞群的共同關聯關系，并發現記憶B細胞和IgA + PC與CD4 + Tfh、Treg和CD8 + Tex細胞強烈共存（圖5K-L）。通過對大量RNA-seq數據的免疫去卷積分析，我們還觀察到TCGA-LUAD隊列中PC和Treg/Tex的簽名分數之間的正相關關系（圖5M）。這些結果表明，LUADs中TIBs和各種TME細胞之間存在明顯的共同關聯關系和串擾。
總結：
這項研究為腫瘤浸潤性B細胞（TIBs）的轉錄、克隆型狀態和表型提供了急需的理解，揭示了它們在早期LUADs免疫病理中的潛在作用，并為治療這種惡性疾病的TIBs靶向免疫療法的開發提供了路線圖。文章的分析思路很不錯，大家快學習起來吧！
參考文獻：
Hao D, Han G, Sinjab A, Gomez-Bolanos LI, Lazcano R, Serrano A, Hernandez SD, Dai E, Cao X, Hu J, Dang M, Wang R, Chu Y, Song X, Zhang J, Parra ER, Wargo JA, Swisher SG, Cascone T, Sepesi B, Futreal AP, Li M, Dubinett SM, Fujimoto J, Solis Soto LM, Wistuba II, Stevenson CS, Spira A, Shalapour S, Kadara H, Wang L. The Single-Cell Immunogenomic Landscape of B and Plasma Cells in Early-Stage Lung Adenocarcinoma. Cancer Discov. 2022 Sep 13:CD-21-1658. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-1658. Epub ahead of print. PMID: 36098652.
