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大家好呀，今天小編給大家帶來本月剛剛發表在Cancer Discovery上的一篇單細胞的文章——Natural coevolution of tumor and immunoenvironment in glioblastoma（IF:38.272）作者一共整合了306,324個多灶性GBM單細胞，包括轉錄組、表觀基因組和蛋白質組數據，來研究原發性GBMs自然進化過程中腫瘤細胞與微環境之間的關系。
4例多灶性GBMs的患者(即NJ01、NJ02、TT01和TT02)(每個病例有2個原發性IDH野生型病變)，對這些樣本進行單細胞RNA測序(NJ01: 21,518個細胞;NJ02: 21715;TT01: 10767個細胞;TT02: 7062細胞)，如下圖所示。
IDH野生型膠質母細胞瘤(GBM)是成年人最常見和最具侵襲性的腦瘤類型。由于腫瘤惡性程度的演變，改善GBM的預后仍然具有挑戰性。標準護理，去腫瘤手術后放療聯合替莫唑胺，中位生存期約15個月。大多數患者在初次治療后十個月內復發。由于GBM中存在顯著的免疫抑制的微環境， ICIs并沒有給GBM患者帶來實質性的臨床益處。腫瘤細胞與免疫細胞之間的通訊在腫瘤進展中起著至關重要的作用。因此，系統地表征GBM的自然發展過程，揭示疾病發展過程中免疫微環境重構的潛在機制至關重要。
由于缺乏合適的模型和技術，目前尚不清楚腫瘤細胞在自然疾病發展過程中如何與腫瘤微環境相互作用。多灶性GBMs被認為是研究GBM自然進化的極好模型，因為它們可能代表了腫瘤發展的不同階段。越來越多的證據表明，大多數多灶性GBMs在早期由共同的腫瘤前體細胞克隆而來，并經歷長期的平行遺傳進化。本文通過對多灶IDH野生型原發性GBMs應用scRNA-seq來研究腫瘤進展，從而對腫瘤自然進化過程進行的高分辨率描述。
基于單細胞mRNA表達譜推斷拷貝數變異結果顯示，四個病例中的兩個病變均來自同一祖先（圖2）。且NJ01和NJ02之間存在時間順序，其中一個病灶處存在拷貝數變化在其他病灶中未發現。這表明一個病灶可能是另一個病灶的種子。
RNA速度分析發現4個腫瘤都有從第2個病灶向第1個病灶轉移的潛在趨勢(圖3C)。第2個病灶的腫瘤細胞可能是新的“bamboo shoots”，最終可能發展為第1個病灶的腫瘤細胞表型。第1個病灶可能比第2個病灶older。
根據非腫瘤細胞的組成成分，超過45%的非腫瘤細胞是髓樣細胞(主要是巨噬細胞)，這與之前的發現一致，髓樣細胞是GBM中主要的非腫瘤細胞群。在GBM中，腫瘤相關的巨噬細胞可能來源于外周骨髓衍生的巨噬細胞(BMDM)或駐留的小膠質細胞(MG)。在四個病例中識別了BMDM和MG細胞。第1個病灶的BMDMs與MG的比值高于第2個病灶(圖3F)。
在第一個結果中作者已經確定了兩種病灶之間的時間順序，接著作者研究了何種轉錄特征可以表征這種進化。差異表達分析發現第1個病灶中表達的DEGs比例明顯高于第2個病灶(圖4A)，表明GBM的自然進化可能伴隨著廣泛的基因激活。通過四個樣本中DEGs的重疊，保留了28個基因。這些基因被進一步篩選在GBM中表達的基因，并進行蛋白-蛋白相互作用，得到一個由CD44、FOSL2和ANXA1等12個基因組成的模塊。將該模塊中的基因標記為自然進化特征(NES)，并假設更高的NES反映了更長的進化史。如圖4B所示，older病灶中表達NES基因的腫瘤細胞比例高于younger的病灶。ssGSEA構建基于NES基因的評分算法。軌跡分析顯示，高NES可能是GBM的進化終點(圖4C)。作者分別使用患者衍生外植體(PDEs)的數據集和小鼠模型，結果符合預期（圖4D,E）。
作者根據細胞狀態特征分數將細胞映射到一個六邊形圖中，NES顯示出從PN亞型到MES亞型的逐步增加和過渡方向(圖4G)。作者接著探討了NES與臨床結果之間的關系，分別使用TCGA和CGGA的GBM數據進行了多因素cox分析，km曲線表明低NES(lNES)預后比高NES(hNES)組好(圖4H)。
之后作者研究了NES轉化過程中的轉錄調控。在TCGA IDH野生型GBMs中發現了四個TF的調控活性評分與hNES顯著正相關以及一些在NES較低樣本中激活的TF(圖5A)。在這些轉錄因子中，E2F1和MYBL2都參與調控細胞增殖和生長。這些TF在大腦發育過程中也表現出明顯的表達模式(圖5B)，其中與hNES相關的TF更可能在發育后期表達。
那么促進NES狀態轉變的潛在因素是什么？作者測試了NES與一系列微環境相關通路的相關性(圖5C)，其中缺氧反應與NES顯著相關。通過比較不同氧水平(即5%和20%)培養下膠質瘤細胞的NES變化，發現缺氧條件下腫瘤細胞的NES更高(圖5D)。低氧條件下敲除腫瘤細胞的低氧誘導因子(如HIF1A)，NES顯著降低，且siHIF1A處理的腫瘤細胞顯著降低了FOSL2 mRNA水平(圖5E，F)，說明低氧在加速NES過渡中發揮了重要作用。基于ChIP-Atlas和ENCODE 的ChIP-seq分析顯示，在各種癌癥類型的FOSL2啟動子上游區域(chr2:28618500-28618900)有一個HIF1A峰值(圖5G)。綜上所述，這些結果表明，缺氧可能通過HI1FA-FOSL2軸潛在地參與NES過渡。
將NES與TCGA IDH野生型GBMs中的BMDM和MG特征相關聯。發現BMDM特征與NES呈正相關，而MG特征與NES無相關性(圖6A)。兩份GBM活檢(NJ03和NJ04)的CyTOF分析也顯示，hNES-like的GBM 有更高的BMDMs(圖6B)。
之后，作者分析了MRI定位活檢中GBM mRNA的表達譜。BMDM和NES在對比強化區域均表現出較高的富集分數，在另一套數據集中發現hNES樣本在PC區域顯著富集(圖6C,D)，提示BMDM和hNES腫瘤細胞容易在腫瘤組織的核心區域富集。綜上，這些發現提示BMDMs浸潤可能與hNES腫瘤細胞有關。
作者將髓樣細胞重新聚類并識別了17個子簇。計算每個子聚類的M2-like和 BMDM-like signature分數。發現mac_PLIN2、mac_IL32和mac_FCN1顯示了大量BMDM-like和M2-like特征的細胞。此外，基于TCGA IDH野生型GBMs的mRNA譜分析了這些BMDM相關子簇的分子標記與NES之間的聯系。發現83%的signature與TCGA IDH野生型GBMs的NES評分呈正相關。
CellphoneDB發現“腫瘤細胞-髓細胞-T細胞”通訊軸是細胞通訊網絡的重要組成部分(圖6F)。髓系細胞(主要是巨噬細胞)可能是腫瘤細胞和T細胞之間的中介細胞，這表明髓系細胞在促進免疫微環境重構和腫瘤進展中具有重要作用。為了揭示BMDMs和hNES腫瘤細胞之間潛在的相互作用軸，CellphoneDB發現older病灶比younger病灶表現出更多的配體受體相互作用(圖6G)。在腫瘤簇中，ANXA1作為配體與BMDMs上的FPR1/3受體相互作用，主要在第1個病灶中(圖6G, H)。最后，通過探索TCGA IDH野生型GBMs的mRNA表達，發現ANXA1的表達與BMDM signature顯著相關(圖6I)，但與MG特征值無關，提示ANXA1可能與BMDMs浸潤有關。
接下來，作者使用ChIP-Atlas尋找潛在的ANXA1調控因子。作為NES特征之一的轉錄因子FOSL2在三個神經祖細胞上的ANXA1啟動子上游區域出現了一個尖峰(圖7A)。TCGA IDH野生型GBMs中，ANXA1表達與FOSL2表達呈正相關(圖7B)。
為了確認來自腫瘤細胞的ANXA1對單核細胞的影響，作者基于單核細胞和U251MG GBM細胞系進行了Transwell遷移試驗。在這些試驗中，腫瘤細胞被敲除ANXA1 (siANXA1)或不敲除(siNC)。在對照組中，單核細胞更容易向腫瘤細胞遷移(圖7C)。72h后，與siANXA1組相比，對照組單核細胞表現出M2樣巨噬細胞的特征(圖7D)，也就是說ANXA1誘導單核細胞分化至免疫抑制狀態。CD8+ T細胞與Transwell試驗衍生的巨噬細胞共培養的活性狀態對照組的IFN γ水平和T細胞增殖率顯著低于其他各組(siANXA1組)(圖7E)。在T細胞與巨噬細胞共培養時，僅用對照組Transwell實驗即可觀察到類似的結果(圖7E)。這些發現在IVY GAP的mRNA表達中也得到了證實(圖7F)。
由于ANXA1可以深刻重塑腫瘤組織的免疫環境，那么，它是否可以幫助腫瘤細胞利用生存優勢。通過比較顱內注射有ANXA1敲低的GL261小鼠GBM細胞系的小鼠與對照組(圖7G, H)，對照組小鼠的腫瘤尺寸明顯大于另一組。shanx1組小鼠的中位生存時間明顯更長(圖7K)。這說明ANXA1在抑制免疫活性和促進腫瘤進展方面發揮重要作用，可能是GBM治療的潛在靶點。
BMDM侵襲加速腫瘤NES轉移和遷移
通過分析GLASS的原發性和復發性GBMs的mRNA圖譜，發現復發性和匹配的原發性GBMs之間BMDM歸一化特征評分的差異與手術間隔時間的增加顯著相關(圖8A)。提示BMDM浸潤與腫瘤進展相關。對腫瘤細胞與M2樣巨噬細胞共培養24、48和72小時進行RNA測序。共培養腫瘤細胞的NES評分高于單一培養條件下的NES評分(圖8B)，表明BMDM細胞有助于加速NES轉化。此外，集富集分析發現，上皮-間充質轉化(EMT)通路與NES顯著相關，且在共培養條件下高度上調，且隨培養時間的延長呈逐步升高趨勢(圖8C)。有報道稱FOSL2是促進EMT的重要轉錄因子。FOSL2 mRNA在與巨噬細胞共培養的腫瘤細胞中表達量較高(圖8D)。此外，EMT的富集也提示這些腫瘤細胞在共培養后可能具有侵襲能力。共培養條件下腫瘤細胞中涉及轉移的基因富集程度較高(圖8E)。此外，基于GSE126725數據的分析顯示，與對照組相比，具有高遷移能力的彌漫性膠質瘤細胞具有更高的NES評分(圖8F)。
作者進一步研究了BMDMs是否與GBMs相互作用并促進腫瘤遷移。基于TCGA IDH野生型數據集的分析顯示，轉移樣信號與BMDM和單核細胞信號評分顯著相關(圖8G)。為了進一步確定哪些細胞因子與NES轉移過程中的遷移能力相關，作者對TCGA IDH野生型GBMs中的細胞因子和NES進行了相關分析。CCL2 和CCL20與NES評分高度相關(圖8H)。當比較四對多灶性GBMs中表達這兩種基因的巨噬細胞的百分比時，發現CCL2易于在巨噬細胞中廣泛表達(圖8I)。在另一套數據中腫瘤浸潤巨噬細胞中CCL2 mRNA水平高于外周血周單核細胞(圖6K)，說明CCL2的上調只是浸潤腫瘤的巨噬細胞的表型。在shCCL2或shNC(對照)條件下進行了48小時的Transwell遷移試驗(圖6L)，證實了CCL2可以促進腫瘤細胞遷移。此外，通過分析TCGA IDH野生型GBM樣本，我們發現與其他患者相比，CCL2級別高的患者預后較差。
該研究整合了多灶性GBMs的單細胞RNA測序，確定FOSL2是older病灶中高表達的特征之一，表明它可能參與了腫瘤的進化。此外，缺氧可能通過激活HIF1A-FOSL2軸潛在地促進NES過渡。FOSL2調節ANXA1，隨后可能募集并誘導單核細胞極化為m2樣巨噬細胞(圖9)。這些極化的BMDMs顯示出免疫抑制表型，顯著減少CD8+ T細胞的增殖和IFNγ的產生，對GBM的免疫治療提出了挑戰。而ANXA1可能是GBM治療的潛在靶點。
作者的研究結果還表明，腫瘤細胞與極化巨噬細胞共培養傾向于增加NES，這可能與多種轉錄因子(如FOSL2)和通路(如EMT)的激活有關。這種進展還伴隨著遷移能力的增強，這與極化巨噬細胞產生的CCL2有關(圖9)。
