經典壞死性凋亡生信思路

導讀

壞死性凋亡是一種由RIP1和RIP3介導的程序性細胞死亡，其特征是胞漿內容物大量滲漏和細胞器腫脹。越來越多的證據表明，壞死性凋亡在癌癥的發病機制中起著不可或缺的作用。壞死性凋亡調節因子的轉錄變化對乳腺癌、結直腸癌、慢性淋巴細胞白血病和膠質母細胞瘤等癌癥的預后有很大影響。本文探討了肺腺癌(LUAD)壞死性凋亡的免疫和表觀遺傳突變格局，確定新的分子表型，并開發基于壞死性凋亡的預后評分系統，以更好地了解LUAD的腫瘤免疫微環境(TIME)。

結果解讀

• 壞死性凋亡調節因子的表觀遺傳和轉錄特征

在TCGA-LUAD隊列中，作者通過R包“DESeq2”鑒定出30個差異表達的壞死性凋亡基因。為了揭示LUAD中壞死性凋亡調節因子的表觀基因組特征，作者分析了甲基化水平。結果表明，DNA啟動子甲基化與TERT和GATA3轉錄表達水平呈負相關，而BACH2與其甲基化水平呈正相關。對拷貝數值的研究表明，30個調節子中存在異常變化，其中TERT和OTULIN具有廣泛的CNV擴增頻率，而CDKN2A在LUAD中顯示顯著的CNV缺失。在根據cBioPortal進行的泛癌突變分析中，CDKN2A的突變類型最多，缺失最深，其次是TERT、TRIM和ZBP，擴增頻率為11%。在561例LUAD患者中，有111例發生了壞死性凋亡相關基因突變，突變頻率為19.79%。但突變頻率最高的是ALK，其次是CDKN2A，剪接位點僅見于CDKN2A和IDH1。上述結果有力地表明，跨壞死凋亡調控基因的失衡與LUAD的發生有關。

• 非監督聚類識別LUAD新亞型

應用基于K-Means的非監督學習方法對29例的壞死性凋亡的調節分子進行分類。主成分分析證實，有三個聚集亞型（A、B、C簇）在表達水平上可能是與壞死性凋亡相關的分子。熱圖顯示了壞死性凋亡調節因子的表達變化。與壞死性凋亡相關的基因在C簇中的表達水平最高，其次是B簇，然后是A簇。然而，患者的年齡在表型之間的分布沒有統計學意義。對三種主要壞死性凋亡表型的KM生存分析顯示，B群的預后優勢相對突出。單因素和多因素Cox比例風險回歸模型顯示，B組和C組均可預測LUAD患者的總生存期。此外，年齡和分期也是生存的潛在預測因素。

• 不同壞死性凋亡表型的TME免疫變化

由于腫瘤免疫在腫瘤進展和細胞增殖中起著至關重要的作用，作者首先推測不同亞型的腫瘤免疫微環境可能是不同的。所以作者首先研究了壞死性凋亡表型與免疫調節劑和免疫檢查點之間的相關性。壞死性凋亡對腫瘤免疫微環境的影響結果表明，趨化因子（如CCL11、CCR1、CXCL10和PPBP）在B和C簇中的表達水平顯著上調。在B和C群中，白細胞介素素、干擾素和一些其他細胞因子的表達也增加，而A簇則下調免疫分子的水平。與A簇和B簇相比，C簇中有7個免疫分子中的表達最高，這些分子都是免疫治療的潛在靶點包括CD274(PD-L1)、PDCD1(PD-1)、CD247、PDCD1LG2(PD-L2)、CTLA-4、TNFRSF9和TNFRSF4。作者進一步調查了20種免疫細胞的浸潤水平。對基因特征的探索表明，免疫細胞在B簇中的浸潤率顯著高于C簇，而在A簇中免疫細胞的比例比較低，如CD4⁺幼稚T細胞、濾泡輔助T細胞和M1巨噬細胞。活化的記憶CD4⁺T細胞在B簇中的豐度最低，而在A、C簇中的豐度較高。用ssGSEA算法計算了抗腫瘤免疫反應事件中免疫周期信號的得分。其中集群B和C中得分較高，但在集群A中表現出特別低的水平。

• 壞死性凋亡表型間基因組改變的研究

作者進一步探索了LUAD分子表型的基因組差異，包括突變特征、SNV和轉錄因子調控網絡的活性。研究發現，集群A和集群C的TMB顯著較高。為了進一步分析這些簇之間的轉錄差異，作者調查了LUAD特異性轉錄因子和與潛在調控因子（與癌癥染色質重塑相關）的關系。作者證實了這三個壞死性凋亡亞群的生物學相關性，因為調節子活性與這些亞群密切相關。與癌變染色質重塑相關的調節子活性信息顯示壞死性凋亡亞群表型之間具有不同的調控模式，表明表觀遺傳驅動的轉錄網絡可能是這些簇的重要分化因素。另外作者發現，簇A和C也具有相似的調節模式，而簇A顯示出更高的SIRT1、SIRT4和SIRT5活性。同時，SIRT1、CLOCK、EP300、HDAC5、SIRT4、SIRT2、HDAC10和HDAC8的調控子在簇B中顯著豐富。

• 信號通路的功能障礙

作者除了探索壞死性凋亡三種表型之間基因表達的差異，還分析了幾種與癌癥相關的信號通路的特點，這有助于理解潛在的潛在調控機制和可用藥通路。在泛癌分析中，壞死性凋亡調節分子與細胞周期、細胞周期A、EMT-A和激素AR-A等激活通路相關，但會抑制細胞周期I、激素AR/ER-I和RTK-I等功能。在LUAD中，大多數壞死性凋亡相關基因與激活了細胞周期、EMT和凋亡等通路有關，與抑制激素ER和RTK信號有關。作者還篩選在壞死性凋亡作用的30個調控因子中的中樞基因。結果表明，TNFRSF21的比重最高，其次是Diablo和TRAF2。為了分析這些不同的壞死性凋亡表型的生物學行為，作者進行了GSVA富集分析。如下圖所示，簇A顯著富集到RNA聚合酶、氨基酰tRNA生物合成、同源重組和DNA復制。在B簇中，Noch、NRF2、RAS和TGFb的得分較高，而在C簇中，細胞周期和TP53信號通路被激活。這提示了壞死性掉啊王在塑造腫瘤免疫微環境和免疫應答方面的重要意義，進一步提示了壞死性凋亡在LUAD化療和免疫治療中的潛在應用前景。

• NecroScore的臨床應用價值

然后，作者開發了一種名為NecroScore的評分系統，基于與壞死性凋亡相關的分子來衡量LUAD患者的壞死性凋亡水平。通過比較三種亞型之間的NecroScore水平，通過Welch單因素方差檢驗發現，NecroScore在C簇中最高，其次是A簇，然后是B簇。根據TCGA和GEO隊列中的KM生存分析，NecroScore高的患者比NecroScore低的患者預后更差。高NecroScore組的不吸煙率較高，晚期患者較多，但年齡和性別分布無統計學差異。單變量COX模型顯示年齡、病理分期和NecroScore與生存結局顯著相關。通過t檢驗確定低NecroScore患者與高NecroScore患者相比具有顯著的治療優勢。在三個獨立的預后因素中，腫瘤分期與患者預后最為相關，其次是年齡，然后是NecroScore。此外，作者還發現，低TMB和高NecroScore的患者預后較差，而高TMB和低NecroScore的患者表現出明顯的預后優勢。

• 藥物發現與化療反應分析

作者分析了壞死性凋亡相關分子與LUAD治療的臨床療效之間的關系。根據GDSC的藥物反應數據，BAHC2、LEF1、DNMT1、TERT、TNFRSF1B、TNFSF10、MPG和ALK等基因與藥物具有協同作用，而Panx1、Ax1、SLC39A7、TNFRSF21和ID1與藥物具有拮抗作用。鑒于壞死性凋亡的調節分子在化療中的重要性，作者進一步分析了NecroScore能否準確預測LUAD患者的化療敏感性。結果表明，NecroScore越高，順鉑、多西紫杉醇和紫杉醇等幾種LUAD特異性藥物的IC50（半抑制濃度）越低。相反，NecroScore低的患者可能對erlotinib(酪氨酸激酶抑制劑/TKI)、gefitinib (EGFR-TK抑制劑)和lapatinib (TKI)更敏感。

全文總結：

這項研究描繪了LUAD腫瘤微環境中壞死性凋亡的免疫格局。這三種表型可以區分LUAD的臨床特征、免疫浸潤和體細胞突變特征。作者建立的NecroScore評分系統可在一定程度上預測患者預后和化療療效。另外用多組學方法對個體腫瘤壞死性凋亡模式進行綜合評估，將加深我們對腫瘤免疫微環境的理解，并制定更有效的免疫治療策略。