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隨著單細胞測序數據的爆發式增長，對于不同細胞亞群之間互作及細胞通訊的解析成為研究者關注的熱點。近期，一篇解讀黑色素瘤腫瘤細胞和CD8+ T細胞之間的異質性串擾對臨床影響的研究于2022年7月發表在Frontiers in Immunology雜志（IF:8.786）上。研究囊括細胞狀態的從頭識別，基于受體-配體互作系統解析腫瘤細胞與CD8+ T細胞的細胞通訊，并揭示出一組關鍵的細胞亞群互作對，能夠影響患者的臨床獲益。分析流程環環相扣，可作為基于公共單細胞測序數據挖掘分析的參考。
Single-Cell Transcriptomic Analysis Reveals the Crosstalk Propensity Between the Tumor Intermediate State and the CD8+ T Exhausted State to be Associated with Clinical Benefits in Melanoma
單細胞轉錄組分析揭示腫瘤中間狀態與CD8+ T細胞耗竭狀態的互作傾向性與黑色素瘤臨床獲益相關
黑色素瘤中腫瘤細胞和CD8+T細胞的互作異質性導致了不同患者免疫治療臨床獲益的巨大差異。先前研究揭示出腫瘤微環境細胞的空間分布和功能狀態具有高度異質性。而黑色素瘤中，腫瘤細胞和CD8+T細胞之間是否存在串擾傾向，以及這種串擾傾向如何影響患者的臨床預后尚不清楚。本研究利用公開的單細胞轉錄組數據，在黑色素瘤中發現了腫瘤細胞和CD8+T細胞的異質性功能狀態和他們之間廣泛的配體-受體互作。此外，基于細胞間通信強度和細胞狀態活性之間的關聯，作者確定了腫瘤中間狀態和CD8+T細胞耗竭狀態之間的串擾傾向。這種串擾傾向通過偽空間接近性、空間共定位和細胞內/細胞間信號轉導網絡進一步得到了驗證。在樣本水平上，腫瘤中間狀態和CD8+T細胞耗竭狀態的互作預示著患者的預后更好，而在免疫治療耐藥患者中觀察到兩者均減少。此外，基于這兩種細胞狀態確定的風險群體呈現腫瘤基因組突變和抗腫瘤免疫反應狀態的差異。作者的研究強調了腫瘤中間狀態和CD8+T細胞耗竭狀態之間的串擾傾向，這可能為指導患者風險分層、預后標志物的開發和潛在治療靶點的開發提供參考。
二、研究背景
皮膚皮膚黑色素瘤(SKCM)是最致命的皮膚惡性腫瘤，具有高突變負荷和增加的細胞可塑性，腫瘤間和腫瘤內的異質性較高。最近，多篇研究證實了黑色素瘤中存在腫瘤細胞（3,4）和CD8+T細胞（4-6）的不同表型和轉錄亞群，通常被稱為不同的細胞狀態。MITF（黑素細胞誘導轉錄因子）-變阻器模型揭示了黑色素瘤中發現的六種不同的表型狀態。這些細胞狀態根據MITF活性從高到低依次排列為高分化狀態、黑素細胞狀態、中間狀態、饑餓狀態、神經嵴干樣細胞狀態和間充質樣狀態（7）。腫瘤內CD8+T細胞群在三個獨立的黑色素瘤隊列中顯示出相似的異質性亞群，包括初始/記憶，細胞毒性，過渡狀態和耗竭狀態的CD8+T細胞亞群。對細胞狀態異質性的分析對探究不同細胞狀態的機制以及細胞狀態如何影響黑色素瘤的進展，如轉移和治療反應至關重要。
三、研究主要內容及結果
1.從頭推斷腫瘤及CD8 T 細胞的狀態亞群
根據以往研究（3）中與腫瘤細胞狀態相關的轉錄調控狀態的單元（regulons, Table S1），利用AUCell算法計算2018個腫瘤細胞的調控活性得分譜，并進行無監督的一致性聚類分析，識別了4種細胞狀態(圖1A)。不同腫瘤細胞狀態可以在黑色素瘤患者中共存(圖1B)，這種現象已在多個研究中報道過（4,1 3）。黑素細胞狀態表現出譜系特異性轉錄因子的調控活性的升高(如SOX10和MITF)和顯著升高的色素沉著和增殖潛能(圖1A、C、D)。與黑素細胞狀態相比，間充質樣狀態失去了黑素細胞轉錄因子的調控活性，但具有顯著的更高的干性和侵襲潛能(圖1A，E，F)。大部分腫瘤細胞處于中間狀態，受EGR3、NFATC2和SOX6的調控(圖1A)。
進一步，識別1759個CD8+T細胞樣本中前2000個高變異基因，并基于這些基因的表達矩陣進行主成分分析（PCA）。基于R包Seurat的FindClusters函數識別了6個CD8+ T細胞亞群，并進行UMAP可視化。然后結合先前報道的（25）（Table S1）和FindAllMarkers函數識別的細胞狀態標記基因對CD8+T細胞亞群進行狀態注釋。同時，基于前2000個高變異基因，應用Monocle2算法，構建不同 CD8+ T細胞亞群的發育軌跡。
C1亞群標記為耗竭狀態，高表達耗竭標記物（如HAVCR2、PDCD1和LAG3）和細胞毒性相關基因（如GZMB、PRF1、GZMA和NKG7）。C2亞群被定義為一種過渡狀態。C3亞群富集初始/記憶T細胞相關基因（例如IL7R、CCR7、SELL和 TCF7）。上述三個主要細胞亞群的狀態定義與軌跡分析中的進展過程相一致（圖2D）。此外，還有其他三個較小的亞群。這些CD8+ T細胞亞群在每個患者中所占的比例也不同（圖2E）。
2.基于配體-受體互作刻畫腫瘤及CD8 T 細胞的串擾景觀
整合5個已發表資源中的人類配體-受體對（Table S2）。這些注釋資源被用來推斷候選的細胞狀態特異性配體-受體互作，以構建腫瘤-CD8+ T細胞互作組（圖S1B, C），并形成配體-受體互作網絡（圖S2A）。腫瘤細胞表達了相對高水平的與抗原呈遞和TGF-信號通路相關的趨化因子和配體，而相應的受體在CD8+ T細胞中廣泛表達，這表明這些配體在誘導黑色素瘤免疫細胞浸潤中可能發揮了重要作用(圖3A)。相反，配體IFNG 及其相關的CD8+ T細胞中表達了促炎細胞因子TNF以及與腫瘤壞死因子家族和細胞毒性相關的配體，表明CD8+ T細胞對腫瘤細胞的殺傷潛力。值得注意的是，在所有細胞狀態中，無論腫瘤細胞作為發送者還是受體，中間狀態腫瘤細胞具有最多的配體-受體互作（圖3B，C，S1D)。這些結果表明，中間狀態腫瘤細胞和神經嵴樣腫瘤細胞可能更頻繁地與CD8+ T細胞發生串擾。
3.解讀腫瘤及CD8 T 細胞之間的串擾傾向性
為了進一步識別細胞狀態特異的配體-受體互作，作者首先應用NicheNet方法（41）計算每個信號接收細胞的配體活性（圖4A，B）。當腫瘤細胞作為受體時，不同腫瘤細胞狀態下某些配體的活性存在明顯差異，如中間腫瘤細胞狀態接受最強的配體IFNG信號（圖4A，C）。但CD8+ T細胞中這種現象不太明顯。
使用與細胞狀態相關的配體作為介質，進一步探索了細胞通訊和細胞狀態之間的關系。發現腫瘤中間狀態細胞和CD8+T耗竭狀態之間具有顯著過出現的配體，并且觀察到觀察到腫瘤細胞對CD8+ T細胞發送信號（超幾何檢驗，p<0.001），說明腫瘤中間狀態細胞可能通過這些配體影響CD8+ T耗竭狀態細胞。
4.驗證腫瘤中間狀態與CD8+ T耗竭狀態之間的串擾傾向
細胞的功能經常會受到鄰近細胞的影響。作者隨后利用CSOmap算法重建腫瘤細胞和CD8+T細胞的三維偽空間(圖5A)，從空間角度驗證這種串擾傾向。在偽空間中，緊密連接結構(tightly linked structures)的主要部分是由耗竭的CD8+T細胞和中間狀態腫瘤細胞構成的(圖5B和C)，并在腫瘤細胞和CD8+T細胞的邊界處緊密連接(圖5D)。而且，耗竭的CD8+T細胞和中間狀態腫瘤細胞的整體互作細胞對最多(圖5E)，表明它們在的偽空間接近性。偽空間接近性主要是由抗原呈遞和趨化因子相關的配體-受體相互作用引起的，如HLA-B-CANX和CXCL10-CXCR3(圖5F)。有趣的是，在一個黑素瘤微區測序數據（MEL1-1）中，在黑素瘤侵襲邊界呈現顯著增加的耗竭CD8+T細胞和中間狀態腫瘤細胞(ssGSEA score, 圖5G-I)。此外，在黑素瘤樣本的空間轉錄組數據中，發現部分空間spot同時富集了耗竭的CD8+T細胞和中間狀態腫瘤細胞(ssGSEA score, 圖5J，K)。這些結果表明耗竭的CD8+T細胞和中間狀態腫瘤細胞的空間共定位。
為了進一步研究哪些分子可能介導腫瘤中間狀態和CD8+T耗竭狀態之間的串擾傾向，作者構建了一個細胞間/細胞內信號轉導網絡(TF-配體-受體-TF)，并發現了多種信號通路參與其中(圖6A)。部分信號轉導過程進一步支持細胞通訊與細胞狀態之間的聯系。例如，PRDM1可以調節CD8+T耗竭細胞分泌的IFNG配體的表達水平，并與中間腫瘤細胞上的IFNGR1/IFNGR2受體結合，進而激活下游的間充質相關轉錄因子，如FOS和NR3C1。隨后利用TCGA-SKCM和GDSC數據驗證他們的關聯關系。
總之，這部分通過偽空間接近性、空間共定位和信號轉導網絡三個方面驗證了腫瘤中間狀態和CD8+T耗竭狀態之間的串擾傾向。
腫瘤中間狀態與CD8+ T耗竭狀態與臨床獲益相關
隨后，作者探討了這種串擾傾向是否與患者的臨床獲益相關。COX比例風險回歸模型(COX-PH)和生存曲線分析表明，腫瘤中間狀態和CD8+T耗竭狀態都能顯著區分患者的總體生存(OS)以及無進展間隔(PFI)(圖7A-C)。而且，兩個指標都高的患者的OS顯著更長(圖7D)。此外，作者進一步評估腫瘤中間狀態和CD8+T耗竭狀態在免疫治療應答中的作用。作者發現在TCGA-SKCM隊列中，IFN-gama反應與腫瘤中間狀態和CD8+T耗竭狀態的ssGSEA評分之間存在顯著正相關(中間狀態：R=0.46，p<2.2e-16；耗竭：R=0.62，p<2.2e-16)(圖7E)。在anti-PD1在治療隊列中，應答者的CD8+T耗竭狀態評分顯著高于無應答者(圖7I)。綜上所述，在免疫治療耐藥樣本中，腫瘤中間狀態和CD8+T耗竭狀態與良好的預后協同相關。
風險群體的基因組突變和免疫特征刻畫
根據上述生存分析，我們將TCGA-SKCM隊列分為高低風險組，其中低風險組對應腫瘤中間狀態較高、CD8+T耗竭狀態得分較高的樣本。作者首先探究了風險分組與先前定義的免疫亞型的關聯。對于泛癌免疫亞型，C2-interferon-gamma顯性亞型在低風險組中占顯著優勢，而高風險組在C1-傷口愈合和C4-淋巴細胞缺失亞型中富集（圖8A）。作者還觀察了風險分組與先前定義的突變分子亞型之間的關聯。結果表明，風險分組跨越了不同的突變分子亞型，且在不同分子亞型的分布上沒有顯著差異（圖8B）。
作者進一步研究了低風險和高風險人群之間的基因組和免疫特征的差異。BRAF在樣本中發生高頻突變，且突變率在低風險組中顯著高于高風險組（突變頻率分別為59.4%和45%，p=0.006）。這與先前觀察的BRAF突變亞型在高低風險組的分布一致，預示了更長的生存（圖8C，D）。與低風險組相比，細胞粘附相關的VIT基因僅在高風險組中發生突變（突變頻率分別為6.3%和0%，p=0.0009，圖8E）。此外，在免疫浸潤方面，低風險組的抗腫瘤免疫反應相關淋巴細胞浸潤明顯升高，如CD8+ T、CD4+ T和活化的NK細胞（圖8F）。綜上所述，低風險組具有較高的BRAF突變和較強的抗腫瘤免疫反應，提示風險分組能夠反映腫瘤基因組信息和抗腫瘤免疫微環境特征。
文章基于通過公開的scRNA-seq數據識別了腫瘤細胞和CD8+ T細胞的不同狀態亞群，發現并解讀了腫瘤中間狀態和CD8+ T耗竭狀態之間的串擾傾向以及對臨床預后的潛在應用價值。
