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線粒體是細胞中的“動力工廠”，為細胞提供主要的能量來源，其中我們細胞生命活動80％能量都是由線粒體提供的。線粒體形態對于細胞維持正常生理代謝和機體發育起著重要的作用，如果線粒體結構和功能發生了異常，就會導致疾病的發生。
近年來，線粒體研究已經成為生命科學及醫學領域的研究熱點，其中，線粒體的融合與分裂維持著線粒體正常的形態、分布和功能。線粒體融合與分裂的失衡通常與人類各種疾病，包括腫瘤的發生發展。
線粒體內有一套獨立于細胞核的遺傳物質——線粒體DNA（mtDNA），人類線粒體DNA的長度為16569bp，擁有37個基因，編碼13種蛋白，這些蛋白都參與細胞的能量代謝。
在人類衰老和一系列疾病中，都涉及線粒體DNA（mtDNA）的表達改變，而線粒體DNA（mtDNA）的突變更是會直接導致數十種嚴重的遺傳疾病。
線粒體是母系遺傳的，是起源于共生細菌的細胞器。它們與宿主共同進化，因此大多數線粒體蛋白質是核編碼的。然而，線粒體保留一個小的16kb DNA基因組，編碼tRNAs、rRNA和呼吸必需的蛋白質。細胞有數百個線粒體，可以是野生型的，也可以是野生型和突變型的混合物，這種狀態被稱為異質性。線粒體是重要的生物能量和生物合成工廠，對正常細胞功能和人類健康至關重要。人類的線粒體疾病可能是毀滅性的，影響許多組織，包括神經系統、心臟和肌肉。線粒體疾病可由病原突變線粒體基因組的母系遺傳引起，這些線粒體基因組表現為高度異質性的疾病，或由必需線粒體基因的功能喪失突變的核遺傳引起。
奧托·瓦爾堡的觀察發現，癌癥具有在氧氣存在下吸收和發酵葡萄糖形成乳酸的特殊特性，這使他提出線粒體呼吸缺陷是有氧糖酵解和癌癥的潛在基礎。然而事實上，瓦爾堡效應只能作為FDG-PET腫瘤顯像的基礎，臨床廣泛使用，并不是所有的腫瘤都具有這種有氧糖酵解的特性。線粒體呼吸缺陷通常不是有氧糖酵解的原因，也不是腫瘤進化過程中通常選擇的原因。在大多數癌癥中，促進糖酵解的是致癌驅動因子突變，如K-ras、c-Myc和磷脂酰肌醇-3 (PI3)激酶的激活或磷酸酶和緊張蛋白同源物和p53的缺失，而不是失活線粒體呼吸復合體的突變。
同時，大多數癌癥仍然保留線粒體功能，包括呼吸。一些腫瘤具有高水平的氧化磷酸化，而其他相對糖酵解的腫瘤仍然保留線粒體呼吸和其他功能。在培養的細胞中通過通量分析定量，發現AKT轉化不顯著影響呼吸作用，而Ras轉化減少呼吸作用，但大部分ATP仍然通過氧化磷酸化產生。對癌癥中線粒體活性需求的功能測試已經揭示了它們的重要性。線粒體轉錄因子Tfam的失活會耗盡腫瘤細胞中的線粒體，從而在原地模型中損害K-ras肺腫瘤的生長。通過毒害mtDNA復制產生r0細胞來耗盡腫瘤細胞的mtDNA，從而破壞腫瘤的發生。此外，mtDNA耗盡r0腫瘤生長恢復的選擇與宿主組織線粒體基因組的水平轉移和呼吸恢復有關。這些和其他發現表明，線粒體在癌癥中的作用不像瓦爾堡想象的那么簡單。相反，他們指出了線粒體功能對腫瘤生長的重要性。
線粒體是生物能量和生物合成的細胞器，從細胞質中吸收底物，并利用它們驅動脂肪酸氧化(FAO)、TCA循環、電子傳遞鏈(ETC)和呼吸，并合成氨基酸、脂類、核苷酸、血紅素、鐵硫團以及NADPH來進行自身的抗氧化防御。通過TCA循環產生的NADH和FADH2為ETC提供動力，從而在線粒體內膜上產生一個質子梯度，通過H+ -ATP合酶的作用產生ATP。二氫月牙酸脫氫酶(DHODH)是嘧啶從頭合成所必需的，需要一個功能性呼吸鏈才能發揮活性。線粒體中產生的活性氧(ROS)是ETC的副產物，可以激活MAP激酶和hif等信號轉導途徑(常氧被稱為假性缺氧)。過量的ROS產生也會導致細胞死亡。線粒體可以隔離Ca2+，并選擇性釋放Ca2+控制信號和廣泛的細胞功能。
線粒體作為先天免疫的信號平臺(例如，MAVS和mtDNA的釋放)。位于線粒體外膜的BCL-2蛋白家族可以通過凋亡控制細胞程序性死亡。BCL-2相關的抗凋亡蛋白阻斷，而BAX和BAK促凋亡蛋白促進細胞色素c從線粒體膜間隙釋放。這種細胞色素c釋放觸發細胞溶膠中的凋亡小體和半胱天冬酶蛋白酶的激活，導致細胞死亡。因此，線粒體和細胞之間的通信協調了一系列對細胞代謝、生長和生存至關重要的功能。
除了作為生物能量的發電站和信號中樞，線粒體還作為生成生物合成基石的平臺。這需要4C(四碳)單元的持續流入來平衡這些單元向氨基酸和其他生物合成產品的流出。TCA循環4C單元的補充被稱為回復性，可以通過丙酮酸的羧化或谷氨酰胺和其他氨基酸的分解代謝發生。
除了提供4C單元外，還需要2C(二碳)單元，后者由可以由脂肪酸、丙酮酸、乙酸和許多氨基酸形成的乙酰輔酶a提供。圖中 4C和2C的縮合反應。線粒體作為生物合成和信號樞紐TCA循環利用糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代謝產生的底物來生成基石和高能電子(NADH和FADH2)，為ETC提供動力。闡明了線粒體產生的主要生物合成產物和線粒體功能調節的信號通路。該單位通過檸檬酸合酶產生檸檬酸，這是唯一的線粒體定位。除了作為上游前體能夠生成所有經典的TCA循環中間體外，檸檬酸鹽還可以輸出到細胞質中，在細胞質中被分解為草酰乙酸和乙酰輔酶a，這是脂質合成和蛋白質修飾所必需的。除了4C和2C單元，線粒體還在嘌呤、胸腺嘧啶和蛋氨酸合成所需的1C(一個碳單元)代謝中發揮核心作用。
已知約100個基因的獲得性核、體細胞和生殖系突變可在癌癥治療中提供選擇性優勢。由于DNA修復缺陷、復制錯誤、致癌物質暴露或衰老導致的突變頻率增加，通過增加這些基因突變的發生促進癌癥。這些癌癥驅動突變及其對癌癥生長的功能后果通常被很好地理解，并且是靶向抗癌藥物開發的主題。
相比之下，線粒體基因組突變在癌癥中的地位和作用就不那么清楚了。利用過去測序技術的低靈敏度來評估異質基因組的小樣本量研究使得體細胞獲得的線粒體基因組突變與癌癥的關聯不明確。此外，現在司空見慣的高級核測序研究通常忽略了線粒體基因組。最近的兩項大規模研究通過大規模平行DNA測序，對來自同一患者的30多種腫瘤類型的2000多種人類癌癥的線粒體基因組突變情況進行了比較，揭示了重要的觀點，發現了許多具有強復制鏈偏倚的體細胞替換，在線粒體重鏈上出現“C轉T”和“A轉G”，表明線粒體聚合酶G錯誤是突變的主要原因。更重要的是，錯義突變是中性的并傾向于同質，而有害的、致病的突變仍然是異質的，存在著消極選擇。這些發現清楚地表明，在人類癌癥中普遍存在保留線粒體基因組功能的選擇壓力。
為了讓細胞正常運作，需要在線粒體和細胞核之間來回通信，這被稱為順行和逆行信號。核基因控制線粒體的生物過程，合成更多的線粒體，滿足增加的代謝需求。相反的生物過程是由自噬和線粒體自噬基因控制的另一層核。
人類癌癥中缺乏致病性線粒體基因組突變的積累，表明線粒體質量控制的積極機制的參與，以防止缺陷線粒體的積累。線粒體自噬是一種特殊形式的自噬，它選擇性地降解和消除多余或受損的線粒體。生物過程和線粒體自噬共同調節線粒體的質量、功能和質量。反過來，有缺陷的線粒體通過膜去極化和線粒體蛋白的級聯磷酸化和泛素化直接向線粒體吞噬機制提供“吃我”信號，而減少的細胞能量輸出(當線粒體總數不足時發生)，通過一般能量傳感器AMP激酶和其他機制觸發線粒體生物過程。
線粒體外膜去極化觸發激酶PINK1的激活，使泛素磷酸化，導致E3連接酶PARKIN募集到線粒體外膜。PARKIN進一步將線粒體蛋白泛素化，從而招募自噬機制來捕獲、吞噬并降解溶酶體中的這些特定線粒體。其他一些與PARKIN無關的線粒體自噬受體蛋白包括BNIP3、NIX、FUNDC1和BCL2L13。盡管推測線粒體自噬在癌癥中的作用是合理的，但缺乏線粒體自噬參與腫瘤發生的直接證據。線粒體質量控制在癌癥中的作用主要是通過操縱真正的自噬基因的遺傳模型獲得的信息。
RAS驅動的癌癥通過激活促進自噬和溶酶體生物發生的基本螺旋環螺旋亮氨酸拉鏈轉錄因子MiTF/TFE家族來上調基礎自噬。在癌癥小鼠模型中，敲除自噬必需基因產生自噬缺陷，導致缺陷線粒體和其他自噬底物的積累，損害線粒體呼吸、細胞生長和生存，同時增加細胞死亡和衰老。對已確診為RAS驅動型肺癌的小鼠進行系統性的急性自噬消融，在對大多數正常組織產生顯著損傷之前，會產生大量的腫瘤消退，這表明一些腫瘤特別依賴自噬。重要的是，與自噬完整產生的癌相比，自噬缺失腫瘤類似于良性的嗜酸細胞瘤，這是一種以缺陷線粒體積累為特征的腫瘤。因此，自噬是腫瘤從良性向惡性發展的必要條件。這也符合RAS驅動的胰腺良性病變惡性進展對自噬的要求。因此，自噬是誘導和需要克服障礙，惡性生長在多種癌癥類型。
由于自噬的主要作用是控制線粒體質量，并可能為線粒體代謝提供底物，因此自噬可能通過這些機制促進腫瘤的發生和惡性腫瘤的發生。這一點缺乏直接的證明，因為自噬介導的循環提供的特定底物的身份，以及它們支持的代謝途徑尚不清楚。腫瘤細胞自噬缺乏導致谷氨酰胺依賴，提示谷氨酰胺可能是自噬供給的底物。在神經元中，線粒體自噬對于去除線粒體基因組損傷中受損的線粒體蛋白非常重要。
幾十年前，奧托·瓦爾堡(Otto Warburg)觀察到癌癥在氧氣存在的情況下發酵葡萄糖，這表明線粒體呼吸的缺陷可能是癌癥的潛在原因。我們現在知道，驅動異常癌細胞增殖的遺傳事件也會改變生化代謝，包括促進有氧糖酵解，但通常不會損害線粒體功能。線粒體提供能量;為新細胞提供構建模塊;并控制氧化還原穩態、致癌信號、先天免疫和凋亡。事實上，線粒體的生物過程和質量控制在癌癥中經常被上調。雖然一些癌癥具有產生致癌代謝物的核編碼線粒體三羧酸(TCA)循環酶的突變，但對致病的線粒體基因組突變存在負選擇。
消除mtDNA可以限制腫瘤的發生，罕見的線粒體基因組突變的人類腫瘤是相對良性的。因此，線粒體在惡性腫瘤的進展中發揮著重要的多功能作用，靶向線粒體提供了治療的機會。
那么接下來我們將介紹一下在線粒體對于癌癥的治療中的一些研究：
使用健康線粒體替代細胞內功能障礙線粒體，以用于疾病治療的方法，被稱為線粒體治療。由于諸多疾病與線粒體障礙相關，因此線粒體治療可能對線粒體相關疾病具有普適性。在2016年，由第三方女性提供正常線粒體的三親嬰兒出生，明確了外源線粒體移植到細胞后可行使正常功能。這種將線粒體微注射到極體或卵母細胞的方法，可用于治療先天性的線粒體疾病。但隨著年齡增長出現的線粒體疾病，則需要其他的線粒體移植途徑。早年研究發現，加入到培養基中的線粒體可修復線粒體受損的細胞。我們的實驗也多次證明了這個結果，并將該發現應用于向動物體內直接進行線粒體注射，以恢復受損組織的正常功能。將分離的線粒體與受體細胞共同孵育，這種技術可以很容易地應用于許多不同類型的細胞。該方法提供了研究向受體細胞內人工轉移的外源線粒體的行為和作用的機會。目前該研究領域逐漸從小眾走向大眾，并在多種疾病的治療中快速展開，成為治療線粒體疾病的一個嶄新的方法。
線粒體是微米級的細胞器。其進入細胞的機制可參考微納米脂質體或膠束等進入細胞的途徑。但需要指出的是，微納米脂質體或膠束等在進入細胞后，逐漸破裂釋放出所包載的藥物；或者與溶酶體融合，經溶酶體酸性環境作用或經酶解，破壞外層膜，造成藥物快速釋放。然而，線粒體在進入細胞后，絕大部分則以完整形態發揮作用，這與微納米載藥系統不同，其機制目前尚不清楚。
線粒體加入到培養基后，可在短短10 min內進入細胞。目前常采用小分子抑制劑來研究熒光標記的線粒體進入細胞的機制，例如，秋水仙堿、細胞松弛素、阿米洛利、氯丙嗪等細胞內吞或巨胞飲抑制劑。線粒體的熒光標記方法常采用依賴于膜電位的熒光探針`和核編碼的靶向線粒體的熒光蛋白等。Kesner等和Patel等的研究表明線粒體進入細胞的方式主要由巨胞飲作用介導。但Sun等和Pacak等則報道線粒體是由肌動蛋白依賴性內吞作用，而非巨胞飲作用介導的方式進入細胞。該研究分別使用細胞松弛素D用于抑制肌動蛋白聚合、使用甲基-β-環糊精阻止內吞作用，并使用諾卡多唑來阻斷隧道納米管，結果顯示這些抑制劑極大地抑制了細胞對線粒體的攝取，從而推斷線粒體進入細胞的途徑主要是肌動蛋白依賴的內吞方式。當線粒體經內吞進入細胞后，形成的包含線粒體的微囊可能在細胞中破裂，釋放出完整的線粒體發揮作用。
惡性腫瘤和正常細胞的一個主要差別在于腫瘤細胞的代謝重編程。而腫瘤線粒體是代謝重編程的關鍵細胞器。惡性腫瘤細胞內的線粒體往往發生數量、結構和功能的改變，以適應腫瘤在酸性和缺氧環境中快速增長的需要。例如，腫瘤線粒體誘導細胞凋亡的能力被遏制、氧化磷酸化減弱而無氧糖酵解增強(Warburg效應)、采用截斷或反向的三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 生成腫瘤代謝中間產物等。因此，正常線粒體若進入惡性腫瘤細胞中，可能會產生兩種不同的結果：(1) 糾正細胞代謝、扭轉惡性化方向、促使腫瘤細胞向正常細胞方向轉化。(2) 正常線粒體難以忍受腫瘤細胞惡劣的內環境，激活細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡。目前的實驗證據支持第2種結果。
目前線粒體已成功應用于乳腺癌、腦膠質瘤、黑色素瘤等的治療和研究?？傮w結果顯示，線粒體可抑制腫瘤細胞的生長增殖。Elliott等從人乳腺上皮細胞MCF-12A分離出正常功能的線粒體并進行熒光染色，線粒體與乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231共孵育后，通過抑制腫瘤細胞糖酵解途徑，使細胞增殖速度降低、乳酸生成減少，并提高了腫瘤細胞對藥物的敏感性。此外，非癌細胞的線粒體進入到侵襲性的骨肉瘤細胞后，前者可逆轉惡性癌細胞的致癌特性，例如降低在缺氧狀態下的細胞增殖活力和侵襲能力、提高凋亡能力、降低對抗癌藥的耐受性和在軟瓊脂中的集落形成能力。在動物體內實驗中，從正常小鼠肝臟中分離的線粒體可顯著抑制黑色素瘤的生長、明顯延長荷瘤小鼠的生存期。其抗腫瘤機制與ATP耗竭、誘導細胞凋亡和壞死有關。另外，由于線粒體和細胞核存在密切的相互交流(Cross-talk) 現象，其中線粒體可反向調控細胞核的基因轉錄，因此線粒體治療的抗腫瘤機制可能與線粒體-核的互作有關。微陣列分析表明線粒體可調節細胞周期蛋白D1、ras、src和p53等幾種致癌途徑，參與其抗腫瘤作用。
此外，線粒體是對環境氧和酸堿度極為敏感的細胞器，在不同的環境中發揮促進細胞存活或誘導細胞死亡的兩極功能。由于正常生理狀態的體細胞以線粒體呼吸作為主要能源，因此補充線粒體可提高其能量供應以改善細胞功能。但在缺氧和酸性環境中的腫瘤細胞，補充外源線粒體則會導致ROS升高、誘導細胞死亡通路。線粒體這種環境響應性的特性將可能使其具有選擇性抗腫瘤作用。
肺癌是一種流行且致命的癌癥類型，轉移性癌癥擴散是導致大多數癌癥相關死亡的原因，為了揭示維持轉移生存或生長所特別需要的基因，研究人員在肺腺癌非轉移和轉移狀態的細胞中進行了基因組規模的緩病毒shrna庫篩選。線粒體核糖體和線粒體相關基因被確定為與轉移特異性致死相關的基因集。從自體肺癌小鼠模型進行的體外轉移源細胞系和離體轉移分析顯示，與非轉移原發腫瘤相比，線粒體膜電位較低，線粒體功能也較低。轉移灶的電子顯微鏡顯示不規則的線粒體失去正常的膜結構。與這些發現一致的是，抑制線粒體轉錄或復制的化合物對轉移源性細胞的生長有更大的影響。這些結果表明，肺腺癌的轉移細胞狀態與一種特殊改變的線粒體功能有關，并且可以用于治療。
圖A，選擇驗證基因的標準。我們采用了三種方法來發現對Met細胞系具有不同影響的基因，并根據描述的標準選擇了240個候選基因。
圖B-C, 20倍體外前(早期)和后(晚期)的代表。在兩個TnonMet (368T1;B)和Met (238N1;C)細胞中，致死基因表達減少，惰性基因不變，有利基因增加。候選基因在Met細胞中的代表性顯著降低。每個點代表一個shRNA。
圖D，每個shRNA對Met和TnonMet細胞的差異影響。每個細胞系在早期時間點和晚期時間點之間表現變化的差異顯示為Met特異性效應。
圖E，根據未歸一化的P值繪制對Met細胞的差異效應，揭示了具有最大折疊效應和高重復性的頂級候選基因。每個點代表一個shRNA。這些方框表示在Met細胞中至少增加2倍(藍色方框)或4倍(紅色方框)的候選shrna，這意味著它們對Met的殺傷力至少是TnonMet細胞的2倍或4倍。
圖F，評估候選基因對體內癌細胞生長的影響的平行體內篩選概述。
圖G，體外和體內對Met細胞的作用基本一致(482N1)。
圖A，二次體外篩選shRNA表達變化的Heatmap，按其對Met細胞的影響程度排序(紅色)。熱圖旁邊列出了體外轉移特異性作用最高的20個shrna?；蛎Q后面的數字表示針對該基因的兩個shrna中的哪一個被識別，
圖B，根據shRNA對Met細胞的影響程度排序的二次體內篩選中shRNA表達變化的Heatmap(紅色)。對應的基因/shRNA名稱和數據值的數據表見Supplementary data Table S9。熱圖旁邊列出了在體內具有最高轉移特異性效應的前20個shrna?；蛎Q后面的數字表示針對該基因的兩個shrna中的哪一個被識別，因為在第二個篩選中每個基因使用兩個shrna。
圖C，在體外培養過程中，在Met細胞系樣品中特異性失去表達的基因的GSEA。上面展示了一個最特異的met致死途徑的例子。豎條是按必需性排序的基因集/通路中所代表的基因，富集分數在上面的圖表中(綠色的)。中間列出了GSEA分析確定的引起met特異性致死shRNA治療反應的途徑;唯一顯著的基因集，表示線粒體核糖體，用粉紅色突出顯示。底部列出了基因本體(GO)項分析的結果。它確定線粒體和線粒體核糖體作為頂級細胞復合體，以轉移特異性致死為目標。
圖A-D, 50 ng/mL溴化乙錠(A)、15 mg/mL強力霉素(B)、200 mmol/L phenformin (C)、2 mmol/L FCCP (D)處理Met (482N1)和TnonMet (394T4)細胞系的體外競爭試驗表明，二者對Met細胞的處理效果更高。數據歸一化為未經處理的對照;給出了在三個重復中至少進行三個獨立實驗的一個代表性實驗。
圖E-H，海馬分析Met和TnonMet細胞系(各3個)來測量耗氧率。根據實驗說明，用E中所示化合物處理細胞。Met細胞系的備用呼吸能力較低，并且耦合效率較低)。 ECAR/OCR比分析表明，糖酵解在Met細胞中使用更高(H)。
圖I-L, Seahorse MitoFuelFlexTest分析Met和TnonMet細胞系(各3個)，以測量燃料容量和依賴性。Met細胞對糖酵解衍生的丙酮酸，它們使用谷氨酰胺的能力較低，表明氧化磷酸化過程中谷氨酰胺作為燃料的比率降低。
圖M，在含半乳糖培養基中培養的Met和TnonMet細胞系(各3個)中，用倒置的CellTiter-Glo分析ATP水平。
圖N，在含半乳糖培養基和含葡萄糖培養基中培養的Met和TnonMet細胞系(各3個;P 0.1377)。數據以半乳糖/葡萄糖比值計算。
圖O，細胞在含葡萄糖和半乳糖培養基中的相對生長分析。數據以δ(葡萄糖半乳糖)計算。
圖P，JC1染色Met(n2)、TnonMet(n2)細胞系，流式細胞術測定相對去極化。
圖Q，流式細胞術對TnonMet(H)和Met(I)細胞系進行ROS染色，測量相對ROS產生。
2020年3月發表在Nature genetics（IF：27.603)上的一篇文章Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers，作者使用pan-cancer研究的WGS和RNA-seq數據，對癌癥線粒體基因組進行了全面的分子表征。
線粒體作為“細胞的動力源”，在通過氧化磷酸化產生大部分細胞能量的生物過程中起著至關重要的作用。環狀的線粒體基因僅有16.6 kb，但仍編碼13種蛋白質，與其他核來源的蛋白質形成呼吸鏈復合體。由于能量代謝的改變是癌癥的共同特征，線粒體可能參與癌變過程。此外線粒體也在與腫瘤發生有內在聯系的其他生物過程中起重要作用，例如生物合成、信號傳導、細胞分化、細胞凋亡、維持對細胞周期和細胞生長的控制等。
目前關于線粒體基因組的研究多為基于小樣本隊列的單一維度研究，并且大多使用全外顯子測序數據，因此尚未獲得跨癌癥類型的線粒體全面、多維分子景觀。此外，過往研究僅集中于線粒體改變的模式，而沒有充分探索線粒體基因組和核基因組之間的相互作用以及線粒體改變的生物醫學意義。本文使用PCAWG生成的38種癌癥的全基因組測序數據，對癌癥線粒體基因組進行了全面的表征。
圖1a,b：多維度整合分析方法概述和mtDNA置換突變的概況
圖1c-f：mtDNA的突變特征：置換類型、年齡和核驅動改變背景
圖2a,b：mtDNA突變數量分布和超突變樣本的突變譜
其中最顯著的是乳腺癌樣本SP6730，有33個突變，其中30個位于一個2kb的區域，導致局部突變率比背景突變率高75倍。獨立的外顯子組和RNA-seq分析證實，這些突變有70%是新發現的，并非胚系突變和測序錯誤造成的突變。其中絕大部分的局部突變（n = 28）為L鏈的T>C置換，并且互相co-clonal，有高度相似的VAFs（~7%）。
這些特征支持28個局部突變(19個錯義，4個沉默和5個tRNA突變）是通過一次“single-hit”的災難性突變機制獲得的，類似造成鏈特異性T>C置換主導的突變譜的機制。這與核基因組的kataegis現象（在癌癥基因組中發現的局部超突變模式）以及一種已報道的mtDNA復雜體細胞突變相似，圖2d介紹了可能的機制：mtDNA在一次“single-hit”中獲得了這些突變，并且突變拷貝通過細胞系的一系列復制，具有了較明顯的VAF（~7%），但導致缺陷表型的概率很低。
圖2c,d：乳腺癌超突變樣本的突變分布及可能的機制
為了研究mtDNA突變對其功能的影響，解釋mtDNA的特異性突變特征，作者以一種對錯義突變選擇壓力的常見測量：dN/dS比率（同義/非同義置換比率），進行了初步分析。結果發現不同類型癌癥、不同VAFs上錯義突變的dN/dS總體上接近1，表明對mtDNA錯義突變的總體選擇接近中性。
作者進一步分析了不同的突變類型的VAF分布，發現并非所有突變都是乘客突變。13個mtDNA基因的截短突變（導致蛋白質產物截短的突變(即無義突變和移碼indels)）在大多數癌癥類型中表現為陰性選擇，VAFs明顯比錯義突變或沉默突變的VAFs受到更大程度的抑制，表明完整的線粒體功能在癌細胞中的重要性。
圖a，腎/結直腸癌/甲狀腺癌與其他癌癥類型截斷突變的VAF積累曲線明顯。為了進行比較，在其他類型的癌癥中，對突變數進行歸一化后，沉默突變和錯義突變產生了類似的曲線。。一般來說，在較高的等位基因頻率水平(紅色)觀察到較少的截斷突變，除了腎癌、結直腸癌和甲狀腺癌類型(藍色)。
圖b，腎嫌色癥、腎乳頭狀癌、結直腸癌和甲狀腺癌積累了過多的高等位基因頻率截斷突變(括號中的樣本大小)。VAF間隔為0.6-1.0時不同癌癥類型的曲線下面積。
圖c, ND5中截斷突變的分布模式。
圖d，腎嫌色細胞癌和腎乳頭狀癌腫瘤基因mtDNA截斷突變與反復體細胞突變的熱圖。MT_truncating是線粒體截斷突變的標準，包括移碼突變和停止增益突變。
圖e，在截斷突變的癌癥樣本中，核基因富集的信號通路的熱圖。
圖a-b：不同癌癥類型中SMNTs的發生頻率以t檢驗比較有無SMNTs的樣本中SMNTs與核基因組結構變異的關系，結果顯示與對照組相比，有SMNTs的樣本在核基因組中具有更多的總體和局部結構變異（P = 1×10?4，圖4b）。圖b中有無SMNTs樣本中核基因組結構變異的發生頻率。
圖4c：不同類型結構變異中SMNT斷點到最近的結構變異斷點的距離
盡管總體上SMNT發生頻率較低（約2%），但一些癌癥樣本顯示了超過3個獨立的SMNT事件（圖4d），并且一些mtDNA片段會大量重排，這表明SMNT事件發生時基因組極不穩定。
圖4d展示了一例膀胱癌樣本基因組中三個獨立SMNT事件的Circos圖，灰色曲線表示染色體重排，紅色曲線表示SMNT。
圖4e：一例HER2+乳腺癌樣本中的SMNT事件。
圖5a：不同癌癥類型的mtDNA拷貝數
進一步使用方差分析或t檢驗比較來自同一組織器官的不同癌癥亞型的mtDNA拷貝數，結果顯示有些癌癥類型表現出不同的mtDNA拷貝數分布（圖5b）
圖5b,c：不同癌癥類型和截短組樣本的mtDNA拷貝數分析
在有配對正常組織的癌癥樣本中比較mtDNA拷貝數的變化(n = 507)，結果顯示在慢性淋巴細胞白血病、肺鱗狀細胞癌和胰腺癌,中癌癥樣本的mtDNA拷貝數增加，但腎透明細胞癌、肝細胞癌和骨髓增殖性腫瘤中減少（圖5d）。這種不同的模式可能是由于癌癥特有的致癌刺激、代謝活動和線粒體功能失常所致，比如最近一項研究顯示腎透明細胞癌中mtDNA拷貝數的顯著降低與HIF1α高度激活導致過氧化物酶體增殖激活受體γ共活化劑1α（線粒體生物生成的關鍵調節子）下調有關，而HIF1α是腎透明細胞癌中最常見和活躍的突變。
為了評估mtDNA拷貝數的潛在生物醫學意義，作者研究了與一些關鍵臨床變量的相關性：
結果發現發現在前列腺癌（圖5e）、結腸直腸癌和皮膚癌中mtDNA拷貝數和診斷時的年齡之間存在顯著正相關。而大多數病例中正常血液的mtDNA拷貝數與年齡呈負相關。
觀察了在多種癌癥類型中mtDNA拷貝數與腫瘤分期之間的相關性，結果顯示慢性淋巴細胞白血病中mtDNA拷貝數的增加與癌癥的高分期有關（圖5f）。
由于前列腺癌和衰老組織中已知存在線粒體基因組的focal copy的獲得和丟失，作者最后還使用WGS數據分析了樣本中mtDNA基因組的結構變異。通過以正常mtDNA序列為參考，計算歸一化的測序深度，進而尋找癌癥mtDNA序列的讀取深度變化來鑒定結構變異區域。結果在2658例癌癥樣本中，3例樣本(0.11%)的mtDNA出現了顯著的結構變異（圖5g）。
為了研究13個mtDNA基因在癌癥中的功能影響，作者使用TCGA的來自13種癌癥類型的4,689例腫瘤樣本的RNA-seq數據對基因表達水平進行定量。
結果顯示基因表達水平與mtDNA拷貝數之間的相關性在不同癌癥中不同。
如圖6a所示，mtDNA基因在三種腎癌（嫌色細胞癌、乳頭狀細胞癌和透明細胞癌）中高表達，而在三種鱗狀細胞癌（宮頸、肺和頭頸部癌）中低表達，這是mtDNA拷貝數在不同癌癥類型中的相對豐度不同所導致的，并且與正常組織中的研究一致。
作者進一步構建了包括線粒體基因和核基因的共表達網絡，研究mtDNA基因及其相關的核基因和通路，然后測量網絡中核基因到一個線粒體基因的邊緣強度，基于所有核基因的排名進行GSEA富集分析。
結果顯示氧化磷酸化是最顯著的富集通路，并且在13種被檢測的癌癥類型中有8種顯著富集(FDR < 0.05)，突出線粒體基因在能量生成中的重要作用（圖6b）。
其他癌癥發生中起重要作用的通路也在多種癌癥中富集，包括與細胞周期相關的通路（MYC靶點、有絲分裂紡錘體、G2/M檢查點和E2F靶點）和DNA修復，已有研究認為mtDNA在這些通路中扮演重要角色。
最后作者檢測了以mtDNA為中心的共表達網絡（圖6c）。結果顯示mtDNA幾乎在所有癌癥類型中都強共表達，作者認為是由于mtDNA基因被轉錄為長的多順反子前體（long polycistronic precursor transcripts）。此外，多個臨床應用的基因與mtDNA基因呈強共表達模式，例如在前列腺癌中，AR、EGFR、DDR2、MAP2K2與mtDNA基因共表達，而TMPRSS2、NF1、PIK3CA、BRCA1和TOP1是mtDNA基因在多種癌癥中最鄰近的基因。
2022年6月2日，來自瑞典哥德堡大學 Maria Falkenberg和卡羅琳斯卡醫學院B. Martin Hllberg合作在Cell上發表了文章Non-coding 7S RNA inhibits transcription via mitochondrial RNA polymerase dimerization，闡明了一個全新的線粒體基因調控機制：一個mtDNA自身編碼的小RNA（不在上述37個基因之中）可以特異性結合到線粒體轉錄酶（POLRMT）上，誘導其構象變化，從而控制mtDNA的基因表達。這一發現為治療諸多相關疾病提供了新的思路。
在1974年，兩名美國科學家發現人類線粒體基因組中有一個長度僅188個核苷酸的小RNA，并根據其在超速離心中的沉降系數將其定名為7S RNA。近50年過去了，人們對它的功能仍一無所知。在這項新研究中，研究人員證明了7S RNA抑制線粒體基因表達。他們首先合成并純化了7S RNA，發現它可以抑制體外構建的線粒體轉錄系統的活性。進一步分析顯示它的抑制作用針對POLRMT。隨后他們使用低溫電子顯微鏡（Cryo-EM）發現7S RNA誘導POLRMT形成二聚體，而二聚體的POLRMT無法結合到mtDNA上，從而也無法啟動線粒體基因表達。
(A)人類線粒體基因組的轉錄。下圖:圓形人類線粒體基因組(mtDNA)的簡化圖，顯示了線粒體啟動子(LSP和HSP)的位置以及每個啟動子的轉錄方向。上圖:放大的非編碼區(non-coding region, NCR)，強調LSP的兩種典型產物:7S RNA和LS轉錄本。在LSP的下游有三個保守的序列塊。
(B)線性模板上HSP或LSP的體外轉錄在不同時間點終止(0、2.5、5、10、15、20、40和60分鐘)。CSB II區域轉錄本和徑流(RO)轉錄本被指出。上面給出了包含HSP的重鏈模板和包含LSP的輕鏈模板的原理圖。
(C)繪制了三種DNA模板隨時間變化的轉錄水平。
(D)使用含有0.400 nM 7S RNA存在的LSP的線性模板進行體外mtDNA轉錄。
(E)在7S RNA或隨機RNA存在下，線性LSP模板上的體外轉錄相對定量(平均SD, n = 3)。
(F)增加POLRMT (20 120 nM)的濃度可以恢復7S RNA (40 nM)存在下的線性LSP轉錄。
(G)在7S RNA(0或40 nM)和TEFM(0、20、40、80 nM)的存在下，使用長線性LSP模板(3000 nt)的體外LSP轉錄。
(H)分離起始期和延長期的轉錄脈沖追逐實驗示意圖。轉錄反應首先在只有32P-UTP(脈沖)的情況下組裝90 s。隨著添加完整的冷NTPs (chase)，延伸率繼續增加。在脈沖期或追逐期的起始點加入7S RNA。
(I) 7S RNA、POLRMT以及7S RNA和POLRMT一起預孵育的分析凝膠過濾，在Superdex 200柱上進行。分別監測POLRMT和7S RNA在280和260 nm處的吸光度(mAU)。
(J)根據參照蛋白的標準曲線計算復合物中POLRMT和7S RNA的分子量，該標準曲線由分子量對洗脫體積的對數(在I中凝膠過濾)構建。
(K)不含蛋白質的7S RNA的RNase I印跡(N/A)， POLRMT (P)， TFB2M (B)，或兩者都有(P + B). RNase T1 (T1)和NaOH (OH)處理的7S RNA作為完全消化對照。
(L)人類7S RNA和CSB區域示意圖在頂部。使用線性LSP模板在存在0 80 nM的7S RNA片段的體外LSP轉錄。
(A)75個線粒體mtrna相關基因7sRNA siRNA差異火山圖。
(B)7sRNA 在siCtrl、siSUV3和siPNPT1 HeLa細胞中的代表性ScanR圖像。
(C)垂直散點圖顯示ScanR檢測到的每個細胞7S RNA強度。每個點代表一個單獨的單元格。
(D)重組人mtEXO復合物降解7S RNA。左:7S RNA (16 nM)與增加濃度的mtEXO復合物或SUV3孵育。
(E) 7S RNA在sitrl、siSUV3或siPNPT1 HeLa細胞中的Northern blot。每個通道都裝載了等量的RNA。
(F)與(D)相同，在HeLa細胞中使用10 3個以上的RNA，不使用siRNA(對照)和混亂對照(siCtrl)處理。
(G) northern blot檢測HeLa細胞中siCtrl、siSUV3或siPNPT1線粒體mRNA和rRNA (12S)。裝載控制:18S RNA。
(H) Denovo在siCtrl和siSUV3 HeLa細胞中合成mtRNA。
(A) 7sRNA FISH和COXIV免疫染色雙標記的siCtrl和siSUV3 HeLa細胞的代表性共聚焦顯微鏡圖像。
(B)垂直散點圖顯示7S RNA顆粒的最大Feret直徑。
(C) 7S RNA FISH和POLRMT免疫染色雙標記siCtrl和siSUV3 HeLa細胞的代表性結構照明顯微鏡(SIM)圖像。比例尺，10mm。與(A)相比，在siCtrl細胞中強度增強，呈現POLRMT和7S RNA的共定位。放大的區域由白色虛線和標杠表示，1mm。
(D)顆粒狀的POLRMT和7S RNA熒光信號的百分比。
(E)圖中POLRMT和7S RNA之間的Mander共定位系數，每個點代表一個單個細胞。
(F)穩定RNA (mtRNA)、新合成RNA (BrU)和COXIV免疫染色三標記的siCtrl和siSUV3 HeLa細胞的代表性共聚焦顯微鏡圖像。
(G) Manders新合成的RNA (BrU)與穩定的RNA (mtRNA)在全細胞或顆粒(siSUV3)中的共定位系數。
(A)從頭合成了siCtrl和siSUV3 HeLa細胞的mtDNA和7S DNA。
(B) 7S RNA FISH和dsDNA免疫染色共標記的具有代表性的HeLa細胞siCtrl、siSUV3和siPNPT1共聚焦顯微鏡圖像。7S RNA是綠色的;dsDNA用紅色表示;DAPI用藍色表示。
(C)用7S RNA FISH和dsDNA免疫染色共同標記的siCtrl和siSUV3 HeLa細胞的代表性共聚焦和受激發射耗盡(STED)顯微鏡圖像。
(D)共聚焦和STED顯微鏡圖像中siCtrl和siSUV3 HeLa細胞類核直徑的相對頻率和平均值。
(E)基于共聚焦的7S RNA和dsDNA強度譜和來自(C) siCtrl細胞插入的STED顯微鏡圖像的行掃描分析。
(A)與線粒體轉錄起始復合物結合的DNase I足跡模板示意圖。TFAM誘導DNA模板上的u型結構，并在啟動子處招募POLRMT和TFB2M。
(B) DNase I足跡顯示，增加7S RNA的濃度(0.1:1,1:1,3:1 7S RNA:POLRMT)可以抑制POLRMT和TFB2M在TSS的結合(箭頭)。蛋白質分別與DNA模板或7S RNA孵育10分鐘。TFAM結合位點(綠色)、POLRMT + TFB2M結合位點(黃色/橙色)和TSS的位置/方向顯示。
(C) 包含LSP TSS的DNase I裂解產物的密度分布。所示的DNA序列(x軸)是非模板鏈(5030方向)。
線粒體基因組編碼氧化磷酸化系統的13個組成部分，并改變線粒體轉錄驅動各種人類病理。在哺乳動物細胞中，一種被稱為7S RNA的多聚腺苷化的非編碼RNA分子從光鏈啟動子的直接下游區域轉錄，其水平隨著生理條件的變化而迅速變化。在這里，我們報道了7S RNA具有調節功能，因為它控制了體外和培養的人類細胞的線粒體轉錄水平。利用低溫em，我們表明POLRMT二聚是誘導與7S RNA的相互作用。由此產生的POLRMT二聚體界面會隔離啟動子識別和解開所必需的結構域，從而阻止轉錄起始。我們提出，非編碼的7S RNA分子是調節哺乳動物細胞線粒體轉錄的負反饋回路的一個組成部分。
線粒體基因表達是一個動態平衡的過程， 那么去除7S RNA，從而恢復POLRMT功能的機制是什么呢？針對這個問題，該文作者們繼續研究并發現RNA降解酶復合體mtEXO可以降解7S RNA，從而形成一個完整的負反饋控制系統：POLRMT以單體形式結合到mtDNA上啟動表達，生成7S RNA。7S RNA反過來誘導POLRMT形成二聚體，抑制其活性。而mtEXO可以降解7S RNA，使得POLRMT恢復活性。
“小RNA分子在細胞核內起著很重要的調控作用，我們的這項研究首次發現了一個可以調控線粒體基因表達的小RNA。這一全新的調控機理會為相關疾病的治療提供新的靶點和思路?！?研究第一作者朱雪峰。研究團隊接下來將致力于研究這一調控機理如何在體內感應能量和代謝的變化以及如何在不同疾病中發揮作用。
線粒體障礙在臨床上可影響體內的多個系統，尤其是那些需要消耗大量能量的組織或器官。目前的研究結果表明，線粒體治療的效果顯著，且可比一般藥物維持更長的時間；此外，自體的線粒體治療尚未出現明顯的不良反應，這些均說明線粒體在一定程度上具有成藥性。但線粒體提取純化的質量控制還有待標準化。 向細胞內補充線粒體往往會出現廣泛的網絡效應，其機制復雜且網點眾多，這是由于線粒體本身是一種多功能的細胞器，但最終的表現則是明確的細胞存活或死亡的兩極效果。需要說明的是，線粒體治療的具體分子機制的相關問題仍有待解答，例如，線粒體通透組織屏障的方式、細胞對外源線粒體的相容性等，這些問題的解決將對揭示線粒體治療的機制至關重要。盡管如此，作為一個新興的方法，線粒體對疾病的治療引人注目并值得期待。
