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各位小伙伴，大家好呀！ 今天給大家帶來的是一篇根據單核和空間轉錄組分析確定了胰腺癌中與新輔助治療相關的多細胞動態變化的一篇文章，在這項研究中，研究者使用單核RNA測序和全轉錄組數字空間分析(DSP) 對PDAC腫瘤標本構建了組成PDAC的細胞亞型和空間群落的高分辨率分子景觀，同時發現了惡性細胞和成纖維細胞中一個新發現的神經樣惡性細胞祖細胞程序，在化療和放療后富集，并且與不良預后相關。進一步基于惡性細胞、成纖維細胞和免疫細胞對接受新輔助治療的胰腺導管腺癌患者進行重新劃分，經過完善的細胞分類學可以為臨床PDAC患者的分層提供框架，提供新的精準靶向治療方案?？靵砗托【幰黄鹂纯窗蓗
研究背景
胰腺導管腺癌越來越多地采用新輔助化療或放射治療的形式，但在很大程度上來說都是一種難以治療的疾病。腫瘤微環境影響細胞毒性的治療效果，但是促進了輔助治療的效果，但是對于腫瘤微環境的空間結構和多細胞相互作用的了解仍然有限，單核RNA測序(snRNA-seq)可以很好地分析惡性細胞和基質細胞，并可以對冷凍樣本進行測序，作者在本研究中對43個腫瘤患者（18個未治療和25個治療）共224988個細胞進行snRNA-seq，發現在治療后殘留的腫瘤衍生的類器官中富集一種獨特的神經樣祖細胞(NRP)惡性程序；同時與全轉錄組空間圖譜相結合確定了幾個不同的多細胞群落，其中包括一個表征了NRP惡性程序和CD8+T細胞的治療富集的細胞亞型。此外，作者發現細胞間受體配體相互作用在治療后殘留腫瘤中富集存在，并作為改進胰腺癌新輔助治療的潛在靶點。
結果一：對冷凍人類PDAC腫瘤樣本進行snRNA-seq分析
作者在本研究中對43個腫瘤患者（18個未治療和25個治療）共224988個細胞進行snRNA-seq（圖1A），在25個接受治療的患者中，14名患者接受FOLFIRINOX多周期化療和多段放療（氟尿嘧啶/卡培他濱CRT)； 5名患者被納入一項臨床試驗(NCT01821729)，研究新輔助CRT加用氯沙坦(CRTL)。另外6例患者接受其他形式的新輔助治療。對數據進行無監督聚類后共分為33個亞群，利用Marker基因進行細胞注釋后得到12種細胞類型。其他細胞類型包括惡性上皮細胞、非惡性上皮細胞、免疫細胞、內分泌細胞和各種基質細胞（胰腺內神經元細胞、內皮細胞、成纖維細胞等）（圖1B-C）。惡性細胞和非惡性細胞由CNA判定。同時作者發現一小部分腺泡細胞(reg +)表達高水平的再生家族成員基因(如REG1A和REG3A)，這些基因與促進胰腺炎癥、腺泡-導管上皮生(ADM)和胰腺上皮內瘤變(PanIN)(圖1d)有關。snRNA-seq捕獲的上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和免疫細胞類型比例的代表性分布與多路離子束成像(MIBI)在單個腫瘤內部和腫瘤之間相比，異質性相差較大(圖1f)。最后，作者進一步說明了新輔助治療相對于CRT患者的免疫功能更強。在5例患者的臨床亞組(未治療、CRT和CRTL)中，接受新輔助治療的腫瘤惡性細胞比例明顯較低(圖1g)，與組織學的情況一致。幾個非惡性細胞亞群在治療組之間存在顯著差異(圖1g)。例如，在免疫部分，新輔助CRTL中CD8+ T細胞的比例高于CRT，并且其中的CD8+ T細胞表達更高水平的效應功能基因(如IL2、CCL4和CCL5)。這些結果與氯沙坦介導的瘤內細胞毒性T細胞活性增加一致。
圖1：未治療和治療的PDAC的snRNA注釋出的細胞類型多樣性。
結果二： ADM和非典型導管細胞。
在上皮腔室中，有低cna共表達導管和腺泡譜系的標記物(圖1b,d和2c,d)，可能反映ADM, ADM在小鼠胰腺腫瘤的發生中起啟動作用。慢性炎癥和激活KRAS突變與ADM狀態的持續和進展到PanIN相關。與腺泡細胞相比，ADM細胞中HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP里面的signature的表達更高(圖2a)。此外，導管細胞的一個細胞亞群表達了高水平的導管(如CFTR)和惡性(如KRT5和KRT19)標記物，但沒有升高的CNAs，因此在這篇文章里面該亞群被定義為非典型導管細胞(圖1b,d和2c,d)。接下來，作者根據該非典型導管細胞亞群進一步進行基因集的分析，發現該非典型導管細胞亞群具有早在PanIN2/3期就表達的基因(如KRT17)，并且相對于ADM細胞來說其具有更高水平的HALLMARK_KRAS_ SIGNALING_UP信號，因此這里作者提出可將該細胞亞群作為ADM進展到PanINs的一個中間過程(圖1b,d和2c,d)。最后，作者進行偽時序分析，推斷出從腺泡細胞到ADM到導管細胞到非典型導管細胞到惡性細胞的主要偽時間軌跡，并且與此同時作者發現HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP信號通路特征平行于上述細胞軌跡并且單調增加，因此該結論更加支持了ADM和非典型導管細胞可以作為PDAC腫瘤發生的相關中間狀態(圖2a,b)。
圖2：通過軌跡分析推斷上皮細胞類型組成腺泡導管化生和非典型導管中間產物
結果三：惡性和成纖維細胞程序共享的腫瘤
盡管大多數腫瘤以基底樣/鱗狀/間充質和經典亞型的惡性細胞為特征(擴展數據圖4a)，但這些狀態可能在一些惡性細胞群中發生同時出現或部分缺失的情況。此外，肌成纖維細胞和炎癥signature在一些不同的CAFs亞群中表達，但抗原遞呈標記未被明確識別，因此作者在這里利用共識性非負矩陣分解(cNMF)方法，在不同腫瘤的惡性細胞和CAFs中重新學習了細胞類型的復發表達模式。作者重點關注來自多個患者的跨細胞共享的cNMF程序(圖3a、b)，識別出了14種惡性細胞程序和4種成纖維細胞程序。除了先前報道的亞型，作者還識別到了三種細胞亞型，分別為離散的鱗狀、基底樣和間充質細胞；并進一步對高CAN的惡性細胞亞群進行分析，確定了腺泡樣程序和神經內分泌樣程序。然而在之前的研究中，大量研究通常將內分泌樣或外分泌樣特征歸因于腫瘤亞群不純的非惡性細胞，但作者的數據表明這些特征存在于惡性細胞中。因此，小編認為這是本文的一個亮點，這里揭示了一個支持異常分化的內分泌和外分泌（ADEX）亞型，并通過原位驗證揭示了一個獨特的NRP程序。
接著作者將單細胞測序分析出的基底樣、鱗狀和間充質程序與之前通過bulk定義的基底樣、鱗狀和準間充質程序進行富集分析；鱗狀細胞程序和基底樣細胞程序與Moffitt基底樣信號顯著重疊，但鱗狀細胞和間充質程序分別與bulk定義的鱗狀細胞和準間充質亞型沒有顯著重疊（圖3c）。
最后作者對新發現的獨特的NRP程序進行功能分析：發現的NRP程序可以同時豐富了神經發育/遷移/粘附等通路基因。并且相對于的研究，作者將NRP和神經內分泌樣程序二者進行了很好的區分（圖3b、d）。此外，NRP程序還與人類蛋白質圖譜中的“腦組織增強”基因顯著富集，最后作者通過多重免疫熒光原位驗證了該程序，并顯示一部分惡性細胞/腺體共同表達細胞角蛋白和NRXN3，NRXN1（典型表達于大腦皮層和尾狀核的神經元和膠質細胞的程序基因）（圖3e、f），揭示了一個富含與神經系統和神經周圍侵襲（PNI）相關的基因的NRP程序。
圖3：PDAC中惡性細胞的分子分層揭示了一種NRP程序
結果四：CAF分類確定了四個程序
對四個CAF程序進行分析，發現富含ACTA2的肌纖維母細胞祖細胞程序與之前研究結果中已發表的myCAF信號重疊（圖4a、b），同時進行signature以及其他功能分析反映了不同的iCAF子集的異質性（圖4b）。
圖4：PDAC中CAF的分子分層
結果五：治療相關惡性腫瘤和CAF程序表達
作者發現，新輔助治療中惡性和CAF程序在不同患者中具有顯著異質性。與未治療組相比，惡性NRP和神經內分泌樣程序在CRT組明顯更高，經典和鱗狀程序較低；同樣，新輔助CRTL相比于未治療組也顯示出更高的NRP程序表達，而經典的鱗狀和基底樣程序的表達較低（圖5A、B）；之后作者通過培養類器官進行實驗驗證，證實了與未治療相比，被治療過的患者類器官細胞系中NRP程序增加（圖5C）。
最后作者將分析結果與臨床相關聯，證明了治療后程序表達也與臨床反應相關。在這里根據患者的外科病理治療反應等級對25個治療樣本進行注釋，對七個惡性譜系剩余惡性細胞進行評分。與未治療的腫瘤相比，NRP方案中殘留的惡性細胞增加(圖5D)；為了評估惡性和CAF的預后相關性，研究者收集來自TCGA和PanCuRx/ICGC9的未治療的原發性PDAC患者的bulk RNA數據，對疾病進展時間（TTP）和總生存期（OS）進行了多變量Cox回歸分析，發現NRP和鱗狀細胞程序與較短的TTP相關，而經典和免疫調節程序與較長的TTP有關(圖5E)。
圖5：NRP在經細胞毒性治療后殘留的腫瘤患者衍生的類器官部分顯著富集，與不良臨床結果相關
結果六：將細胞類型程序映射到腫瘤結構（與空轉結合）
作者捕獲和分析感興趣區域(ROI)的mRNA計數(圖6A)，在這里作者使用四色免疫熒光法選擇具有不同腫瘤細胞、CAFs和免疫細胞模式的ROI;為ROI內的每個細胞類型段創建自定義照明區域(AOIs);從每個AOI中切割并收集條形碼并量化條碼豐度。用DSP分析了21個腫瘤，并用snRNA-seq細胞類型特征對數據進行反卷積。觀測得到上皮、CAF和免疫AOIs按細胞類型聚集。然后作者將每個惡性和CAF程序的表達映射到ROI上，結果顯示NRP和神經內分泌樣惡性程序更加富集于CRT的ROI中，與snRNA分析一致。
圖6：惡性腫瘤和CAF程序的空間映射揭示了程序特異性與腫瘤內和腫瘤間異質性的關系
為了識別多細胞空間關聯，研究者將ROI中的每對特征關聯起來，以產生惡性譜系程序、CAF程序、免疫細胞類型的比例以及惡性、成纖維細胞和免疫細胞ROI面積的空間協變矩陣。最后作者通過無監督聚類確定了三個具有不同惡性、基質和免疫特征的多細胞亞群。對單個多細胞亞型進行功能分析發現，治療富集亞型1的特點是其內部NRP與神經內分泌樣惡性程序、嗜神經性CAF程序和CD8+T細胞之間的關聯，同時富集間充質和腺泡惡性程序和免疫調節CAF程序。鱗狀細胞-基底細胞樣亞型2的特點是鱗狀細胞樣和基底細胞樣惡性程序與多種淋巴和骨髓細胞類型、較高的上皮細胞和免疫含量以及較低的CAF含量相關。經典細胞樣亞型3表現出經典惡性程序、更高的CAF和更低的免疫比例。snRNA-seq數據中患者級別特征的聚類概括了其中一些關聯。
圖7：惡性腫瘤程序、CAF程序和免疫細胞組成的空間分析揭示了三種不同的多細胞群落和治療相關的受體-配體相互作用
自此這篇文章的主題內容就介紹完畢啦，總的來講，這項研究利用了胰腺導管腺癌患者腫瘤組織樣本進行單細胞核以及空間轉錄組分析，探究了新輔助治療下相對于放療和未治療患者改變的分子機制。一系列結果表明，新輔助治療的效果與本研究新識別到的惡性細胞亞程序和成纖維亞程序顯著相關。這項工作橋面的結合單細胞多組學數據以及空間轉錄組，對胰腺導管腺癌新輔助治療患者提出了精準的分子分型，對未來臨床設計新的新輔助治療方案具有重要參考價值。
