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大家好，今天給大家分享的是2022年6月份發表在Nature Medicine（IF=87.2）的文章。本文是由多個重點血液病研究中心的研究者集思廣益，闡述了白血病異質性和預測藥物反應之間的相關性。
A cellular hierarchy framework for understanding heterogeneity and predicting drug response in acute myeloid leukemia
理解急性髓系白血病異質性和預測藥物反應的細胞層次框架
研究背景：急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種破壞性疾病，其特征是患者間和患者中廣泛異質性。預后不佳的原因是首次化療耐藥和獲得緩解的患者高復發率，這凸顯了普通化療對治療大多數AML存在不足。最近，許多針對不同細胞機制的新療法已獲批或正在進行臨床試驗，為化療提供了替代方案。然而，患者對這些新療法的反應也是不同的，缺乏為每個患者選擇最佳療法的可靠方法。前期很多研究形成了AML是由罕見白血病干細胞（LSCs）維持的證據。自那以后，LSCs被證明可介導復發，基于LSCs的基因表達干性已成為化療預后預測因子。雖然LSCs是一個重要治療靶點，但該模型在治療選擇方面提供了有限指導。長期以來，癌癥一直被認為是正常組織發育的縮影，而AML是研究的最好的癌癥系統，在這個系統中，白血病細胞被認為是一個類似于正常血液發育的層級。AML中細胞層次以不同方式扭曲，這取決于它們基因改變和細胞起源。每個患者白血病細胞組成可能反映了疾病LSCs上特定突變的功能后果。因此，對白血病層次的探究可能為整合AML遺傳和干細胞模型提供了一個潛在機會。單細胞RNA測序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）已成為解剖細胞層次結構的有力工具。在這項研究中，使用不同AML干細胞、祖細胞和成熟細胞類型的單細胞圖譜，通過在AML轉錄組上的基因表達反卷積，對1000多名AML患者的細胞層次結構進行了描述。這種描述AML異質性的方法使AML基因組和干細胞模型得以整合，從而為理解疾病生物學和預測藥物反應提供了一個新框架。
摘要：AML治療前景正在發生變化，較有前途的治療方法進入臨床轉化，但患者反應仍不一致，缺乏針對特定治療的生物標志物。為了了解疾病異質性與治療反應之間的聯系，作者使用白血病干細胞、祖細胞和成熟細胞類型的單細胞圖譜，通過反卷積方法，從1000多名患者轉錄組數據中確定了白血病細胞層次結構。白血病等級組成與功能、基因組和臨床特性相關，共聚合為四個總體級別，跨越原始、成熟、GMP和中級。關鍵的是，沿著原始與GMP軸或原始與成熟軸層次組成變化分別與化療反應或靶向治療藥物敏感性相關。來自原始和成熟軸的7個基因生物標志物與105種藥物反應相關。細胞層次構成為理解AML疾病生物學和推進精準醫學提供了一個新框架。
結果：
1.白血病干細胞和祖細胞的異質性。
作為揭示AML中細胞層次結構的第一步，作者重新分析了12名診斷為AML的13653個細胞scRNA-seq，重點關注原始干細胞和祖細胞群（白血病干細胞和祖細胞（leukemia stem and progenitor cells，LSPCs））。作者先前確定了兩種正常人類造血干細胞轉錄組群體：一種是轉錄組多樣性低的深度靜止群體，另一種是CDK6表達較高的較淺靜止狀態。作者對LSPCs進行分析確定了12例患者共屬于3個不同亞群（圖1a）。一個亞群轉錄組多樣性較低，在核心LSC程序中富集，但在其他方面表現為不活躍，將這個亞群命名為靜止LSPC。第二個亞群CDK6和E2F3靶點富集，提示細胞周期啟動以及炎癥特征提示骨髓分化啟動，將這個亞群命名為Primed LSPC。第三亞群表現為富集CTCF靶點提示干細胞激活和廣泛富集E2F靶點表明細胞周期進展（圖1b）。接下來作者試圖了解這些已定義的AML細胞群及其組織層次是如何與AML功能、生物學和臨床特性相關的。使用基因表達反卷積從AML轉錄組推斷白血病等級組成（圖1c）。因此，作者對先前通過微陣列評估的111個AML片段進行RNA-seq，其中通過異種移植確定了LSC活性，并應用反卷積確定每個片段細胞類型組成（圖1d）。靜止LSPC和啟動LSPC的LSC+組分高度富集，而循環LSPC則不富集（圖1e）。相反，單核樣細胞LSC-組分高度富集（圖1e）。鑒于免疫表型不能一致性預測LSC活性，作者通過訓練分類器預測AML分型中基于細胞類型組成和CD34/CD38狀態的LSC活性，從而將反卷積與免疫表型進行比較。在免疫表型上訓練分類器始終優于在白血病細胞組成上，甚至優于以靜態LSPC豐度作為單一變量訓練模型（圖1f）。最后，在一個獨立大量AML樣本數據集中，通過限制性稀釋分析評估發現，靜止LSPC與高LSC頻率相關（圖1g）。總的來說，這些發現在轉錄組LSPC狀態和位于白血病細胞等級頂端的功能性LSCs之間建立了一種新聯系，表明LSC活性可以通過患者等級反卷積推斷出來。
圖1 scRNA-seq中LSPC的功能意義。a，4163個AML LSPCs圖。b，TF在每種白血病細胞類型中的調節活性。c，來自scRNA-seq參考特征AML反卷積方法示意圖。d，評估來自scRNA-seq的AML細胞狀態與功能性LSC活性之間關系的實驗設計。e，72個LSC+和38個LSC? AML片段的白血病細胞類型富集。f，預測110個已排序的AML組分中功能性LSC活性的RF分類器模型性能。g，在Pabst等人定義的低、中和高LSC頻率的患者樣本中，靜止LSPC的相對豐度。
2.層次組成與AML基因組學相關。
維持患者AML的LSCs分化特性反映在它們細胞組成中。為了研究這些層次如何在患者樣本中變化，以及它們如何與AML分子和臨床特征相關，應用反卷積方法，從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、BEAT-AML和白血病基因隊列的864例患者樣本中推斷7種白血病細胞類型和7種非白血病免疫群體豐富度。基于患者白血病細胞層次結構聚類發現顯示四種不同亞型：原始（淺層，LSPC富集），成熟（陡峭層，富集成熟單核樣和cDC樣細胞），GMP（以GMP樣細胞為主）和中間（均衡分布）（圖2a-c）。患者層次是沿著兩個主成分分離的：PC1，跨越從原始到GMP的連續統一體；PC2，跨越原始到成熟（圖2a）。由細胞遺傳學改變產生的層次結構主要沿著原體與GMP軸分離PC1，其中，不利的細胞遺傳學改變產生原始層次，有利的細胞遺傳學改變產生GMP優勢層次（圖2d）。由基因驅動突變及其組合產生的細胞層次結構主要沿著原始軸與成熟軸PC2分離，反映了它們對AML分化程度的影響（圖2e）。與觀察到的有利和不利細胞遺傳學相關，不同等級亞型患者生存結果也不同，其中原始等級與較差結果相關，而GMP優勢等級與較好結果相關。這些數據表明，通過分層組成描述AML患者間異質性可以捕獲并潛在整合AML異質性基因組和干細胞模型。現有AML預后評分與這一特定軸相關，指出了決定分層組成的生物學特性的重要性。
圖2 AML層次組成與基因組學和生存率相關。a，基于其細胞層次的結構組成，對864例來自TCGA、BEAT-AML和白細胞基因隊列的AML患者進行PCA分析。b，每個患者中每種白血病細胞類型的相對豐度。c，描述原始、GMP和成熟層次結構的細胞組成。d，沿著原始-GMP軸（PC1）描述細胞遺傳群的密度圖。細胞遺傳學改變以預后意義著色，其中紅色表示預后不良，綠色表示預后良好。e，沿著原始與成熟軸（PC2）描述常見驅動突變組合的密度圖。f，TCGA和BEAT-AML隊列中AML分級亞型的總生存期結果。g，針對三個患者隊列中每種AML分級亞型的單變量和成對HRs。
3.診斷與復發之間的層次結構變化。
鑒于在AML中觀察到分級組成和臨床結果之間的關聯，作者考慮這些分級組成是否隨著疾病發展而演變。為了了解AML分級在疾病發展過程中的變化，作者對從四個獨立隊列中收集的診斷和誘導化療后復發的44對AML樣本進行反卷積分析（圖3a）。在診斷時，患者表現出不同層次組成，但由于復發，大多數患者原始LSPC顯著增加，特別是靜止LSPC（圖3c）。為了在單細胞水平上驗證這一發現，作者分析了8例復發AML患者的scRNA-seq數據，并觀察到與12例診斷性AML樣本的scRNA-seq數據相比，都存在一致較高的LSPC豐度（圖3d）。盡管復發時LSPC擴張與先前功能性異種移植研究一致，為了驗證這一發現，作者還評估了來自分子特征數據庫（Molecular Signatures Database，MSigDB）的12441個生物特征，涵蓋生物途徑、免疫過程和癌癥/AML特異性基因集，發現復發時總LSPC的富集比來自MSigDB的頂級特征顯著兩個數量級（圖3e）。從診斷到復發這些細胞組成變化也有助于了解AML的克隆進化模式。例如，在NPM1突變AML中，FLT3-ITD改變在復發時反復獲得，而NRAS和FLT3-TKD的改變在復發時反復丟失。事實上，帶有NPM1c的FLT3-ITD產生了原始層次結構（圖3f），而帶有NPM1c突變NRAS或FLT3-TKD產生了成熟層次結構（圖3g）。對于分析的其中一個患者子集，從診斷到復發的層次組成變化與克隆進化模式一致（圖3h）。在沒有明顯遺傳變化的情況下發生了等級結構變化，這可能是由于非遺傳進化模式（圖3i）。總之，研究結果確立了LSPC擴張是AML化療后復發的不同進化路徑的共同標志。
圖3 從診斷到復發的層次結構轉變。a，來自4個獨立隊列的44個配對AML樣本從診斷到復發層次組成轉變。b，描述從診斷到復發層次亞型分布圖。c，44對診斷和復發患者之間白血病細胞類型豐度變化，包括總LSPC豐度。d，12個診斷性AMLs的scRNA-seq，與8個復發性AMLs的scRNA-seq比較。e，對照MSigDB中的12441個特征，對從診斷到復發層次結構變化的顯著性和量級進行分析。f，伴有NPM1c+FLT3-ITD改變的患者復發時擴大。g，同時發生NPM1c+NRAS或NPM1c+FLT3-TKD改變的患者，復發時丟失。h，i，從診斷到復發克隆和細胞類型組成變化。克隆組成和細胞類型組成發生一致變化患者（h），以及細胞類型組成發生實質性變化的患者（i），與已知驅動突變相比，克隆組成檢測到的變化極小。
4.原始和成熟軸捕獲體外藥物敏感性。
已經證明化療后生存結果與層次組成（即原始與GMP軸）有關，作者考慮具有不同細胞組成的AML樣本對新研究療法的脆弱性是否不同。來自兩個公共數據集的體外藥敏數據與細胞類型豐度整合，生成每種白血病細胞類型的藥敏概況（圖4a）。這揭示了原始細胞和成熟細胞之間藥物反應的巨大差異，藥物反應分離主要發生在原始和成熟軸上，其中PC2顯著相關，對37種BEAT-AML篩查藥物和64種單獨篩查藥物均有應答（圖4b）。通過LASSO回歸對PC2上LSC17基因進行再訓練，確定一個7基因譜系分類亞評分（圖4c）。在驗證隊列中，LinClass-7與PC2相關性良好，并與33種BEAT-AML藥物以及Lee等人的72種藥物敏感性顯著相關（圖4d），每種藥物靶點都是原始細胞或成熟細胞（圖4e）。相比之下，LinClass-7高（原始>成熟）AML患者從吉妥珠單抗中沒有獲得明顯生存好處（圖4f）。值得注意的是，作者觀察到吉妥珠單抗靶蛋白CD33表達水平與LinClass-7（圖4g）或PC之間沒有關聯，并發現大多數患者無論哪種層次亞型都表達CD33+（圖4h）。總之，數據證明了一個概念，即基因表達評分很容易生成捕獲白血病層次組成的變化軸，這些可能代表對非化療藥物反應的強大生物標志物。它們也是為數不多的可廣泛應用于成人和兒童AML的生物標志物之一。
圖4 AML分級組成是靶向治療反應的決定因素。a，在202例BEAT-AML患者樣本中，細胞類型豐度和體外藥物敏感性之間的相關性。b，原始軸與成熟軸（PC2）之間的相關性，與BEAT-AML篩查體外藥物敏感性相關，識別出優先靶向原始或成熟AML細胞的藥物。c，LinClass-7捕獲原始與成熟軸。d，與LinClass-7的相關性確定靶向BEAT-AML原始細胞或成熟細胞的藥物以及單獨原發性AML藥物篩查。e，對于BCL2抑制劑維奈托克、低甲基化試劑阿扎胞苷、MEK抑制劑司美替尼和MTOR抑制劑依維莫司，LinClass-7高AMLs和低AMLs的藥物敏感性。f，ALFA-0701試驗亞組評估吉妥珠單抗。g，在23例多倫多PMH AML患者中，通過Pearson相關性評估LinClass-7與CD33之間缺乏相關性。h，151例TCGA患者CD33陽性率。
5.AML分級框架指導臨床前藥物研究。
為了了解藥物治療如何影響細胞組成，作者從Gene Expression Omnibus（GEO）和ArrayExpress的43個數據集中提取RNA-seq數據，對藥物治療前后測序的人類AML細胞進行反卷積（圖5a，b）。UMAP顯示藥物治療后細胞組成變化，并根據其誘導變化對治療進行聚類分析（圖5c，d）。在153種處理條件下，125種導致細胞類型組成發生顯著變化。77個處理條件導致PC2顯著增加，這可能反映了分化，但大多數處理導致了GMP樣母細胞耗盡，少數處理導致更原始的靜態LSPC或啟動LSPC群體耗盡（圖5d）。例如，ATRA誘導的分化主要來自GMP樣細胞（圖5e）。相反，DHODH抑制劑布喹那誘導的分化伴隨著靜止LSPC豐度而降低，這表明該藥物可能更好地耗盡干細胞庫（圖5e）。塞利尼索一種靶向核輸出蛋白XPO1的藥物（圖5f）。在單細胞水平，XPO1表達和核輸出過程在cycle LSPC群中富集（圖5g），該細胞群豐度與BEAT-AML篩選的體外塞利尼索敏感性相關（圖5h）。值得注意的是，在不同遺傳背景下，用塞利尼索處理原發性AML樣本會導致體內外循環LSPC群耗盡（圖5i，j）。總之，這些數據闡明藥物治療后細胞組成的變化，并為臨床前設置候選藥物優先級提供了功能相關解讀。
接下來的問題是：如何在更接近臨床轉化的臨床前研究中使用層次分級，例如在體內藥物反應背景下。作者使用了兩種藥物患者源性異種移植（patient-derived xenograft，PDX）反應數據：菲卓替尼（一種已批準的用于骨髓增生性腫瘤的JAK2抑制劑）和CC-90009（一種誘導小腦介導的GSPT1降解的免疫調節劑）。在658例接受藥物治療或對照PDX接受者中，AML樣本接受治療。來自異種移植前原發患者樣本的反卷積RNA-seq根據層次組成進行聚類，分為原始、中間/GMP或成熟（圖6a，b）。菲卓替尼主要靶點JAK2主要在單核細胞樣和cDC樣細胞中表達（圖6c）。反過來，這些成熟細胞在菲卓替尼體內反應良好的患者樣本中富集（圖6d）。對菲卓替尼反應的亞組分析顯示，在成熟層次AMLs中有效率較高，而在其他層次亞型AMLs中有效率較低（圖6e）。CC-90009靶蛋白GSPT1在循環LSPC和GMP樣細胞中高表達（圖6f）。反應者中GMP樣細胞擴增，而部分反應者和無反應者中靜止LSPCs擴增（圖6g）。亞組分析顯示CC-90009對成熟和中間/GMP層次的AMLs有較高療效。相比之下，具有Primitive層次結構的小鼠異質性反應率為40%（圖6h）。為了更好地理解患者樣本對菲卓替尼和CC-90009異質反應，比較了菲卓替尼和CC-90009治療條件下有反應和無反應的AML樣本基因組特征。在原始AML層次中，NPM1c突變與菲卓替尼良好反應和CC-90009不良反應相關，而缺乏NPM1c突變的原始AML表現出CC-90009良好反應和菲卓替尼不良反應（圖6e，h）。因此，來自8例具有不同層次組成的AML患者PDX異種移植模型分別接受兩種藥物單獨或聯合治療。盡管對單一藥物反應各不相同，但8例患者中有7例PDXs對聯合治療和消除白血病完全有效（圖6i）。總的來說，在PDX模型中，對菲卓替尼、CC-90009和聯合治療的應答均與層次組成顯著相關（圖6j）。這些數據表明，通過等級組成對AML進行分層可以幫助確定可能從特定治療中受益的患者樣本，同時也為基于等級靶向顯示互補性藥物配對設計聯合方案提供了證明。
圖5 藥物治療后細胞組成變化。a，從文獻中重新分析臨床前的實驗設計。b、再分析方法示意圖。c，根據細胞類型組成變化對藥物治療進行聚類。d，描述每個簇內藥物治療后細胞類型組成變化熱圖。e，針對特定過程藥物治療的例子以及治療后每種細胞類型豐度的變化。f，體外塞利尼索處理NPM1突變AMLs后細胞組成的變化。g，XPO1（塞利尼索的靶點）及其相關基因和通路在scRNA-seq的AML blast亞群中的平均表達量。h，在202例有塞利尼索敏感性報道的BEAT-AML診斷樣本中，40例細胞類型豐度與體外藥物敏感性之間的相關性。i，體外用DMSO對照或塞利尼索處理的三個AML原始樣本LSPC-Cycle豐度。j，在體內用DMSO對照或塞利尼索處理的三個原發性AML樣品中LSPC-Cycle豐度。
圖6 基于層次分層預測體內對菲卓替尼和CC-90009的反應。a，在PDX模型中評估AML層次組成與藥物反應之間關系的實驗設計。b，在體內藥物治療前原發患者樣本的層次組成。c，菲卓替尼靶點JAK2在scRNA-seq AML blast亞群中表達。d，對菲卓替尼有反應者和部分/無反應者之間細胞類型豐度的差異。e，按白血病等級亞型分層分析菲卓替尼異種移植反應。f，CC-90009靶點GSPT1在scRNA-seq AML blast亞群中表達。g，CC-90009反應者和部分/無反應者之間細胞類型豐度的差異。h，按白血病等級亞型分層分析CC-90009的異種移植反應。i，按等級分層分析菲卓替尼+CC-90009聯合治療的反應。j，菲卓替尼、CC-90009及聯合治療異種移植AML患者的體內療效。
結論：總的來說文章研究表明，專注于每個白血病患者細胞層次結構組成的生物標記物具有強大潛力來指導這些療法的開發和選擇，從而為AML精準醫療框架奠定基礎。
參考文獻：Zeng A G X, Bansal S, Jin L, et al. A cellular hierarchy framework for understanding heterogeneity and predicting drug response in acute myeloid leukemia[J]. Nat Med. 2022,28(6):1212-1223.
