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單細胞轉錄組揭示肺類癌的腫瘤微環境
單細胞轉錄組技術已被用作分析傳統肺癌腫瘤細胞異質性的有力工具。但肺類癌在單細胞水平上的特征尚未確定。今天小編給大家分享一篇2022年2月22日發表在INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER（IF：7.396）上的文章，這項研究通過類癌細胞的單細胞轉錄組反映了腫瘤間的異質性和臨床病理特征。并且為肺類癌微環境的細胞組成以及潛在的細胞間相互作用提供了全面的見解。揭示了肺類癌新的生物標志物和治療靶點。
一、研究背景
肺癌是一種異質性疾病，包括不同的組織病理學亞型。肺類癌，也稱為肺神經內分泌腫瘤或肺類癌，是一種罕見的肺部腫瘤，平均而言，肺類癌比傳統肺癌有更好的預后。但是仍有疾病復發和轉移擴散的風險。最近的幾項單細胞研究為更常見的肺癌（如腺癌和鱗狀細胞癌）的細胞異質性提供了詳細的見解。然而，肺類癌在單細胞水平上的特征仍然未知。
此外，預測靶標和免疫治療的有效性受到腫瘤內異質性的限制，其中腫瘤可能存在原發性耐藥腫瘤細胞亞克隆，以及復雜的腫瘤微環境，從而影響對腫瘤的免疫反應。而單細胞基因表達譜可以克服這一限制，并已經為肺腺癌的細胞異質性提供了有價值的見解。
為了研究肺類癌中的細胞組成和單細胞基因表達譜，作者對3個類癌腫瘤和正常肺組織樣本進行了單細胞RNA測序，并綜合分析了肺類癌的細胞組成。通過分析類癌腫瘤細胞的單細胞基因表達譜揭示了臨床病理特征。作者還發現腫瘤微環境的特征包括具有非炎癥特征的單核細胞衍生的骨髓細胞、腫瘤相關的內皮細胞、一系列血管平滑肌細胞和周皮細胞以及具有癌癥相關成纖維細胞樣特征的肌成纖維細胞。
二、結果
1.單細胞RNA測序揭示肺類癌的細胞多樣性
為了在單細胞水平上探討肺類癌的細胞組成及其腫瘤微環境，作者從3例未經治療的肺類癌患者(圖1A)中采集了腫瘤組織和正常肺組織的新鮮組織樣本。這3例患者的腫瘤細胞均顯示呈巢狀生長，并表達神經內分泌標記蛋白突觸素和嗜色粒蛋白A(圖1B)。兩例非典型類癌(患者2和3)在診斷時均有區域淋巴結轉移。這些腫瘤組織樣本被酶解，并進行單細胞RNA測序。還有來自先前發表的隊列研究(患者4-10)的7個正常肺組織樣本的單細胞基因表達數據被納入隨后的分析。本研究共分析了73105個單細胞的轉錄組，其中經過質量控制和篩選后保留了64697個高質量的單細胞轉錄組(圖1C)。
接下來，作者對單細胞轉錄組進行聚類分析的可視化，發現正常和腫瘤組織樣本之間存在明顯的偏態(圖1D)。并且不同患者的單細胞轉錄組沒有表現出樣本間的批次效應(圖1E)。此外，作者通過典型標記基因的基因表達定義了上皮細胞、免疫細胞和基質細胞(圖1F)。作者發現在腫瘤組織樣本中，主要包括上皮細胞和基質細胞的單細胞轉錄組，而在正常組織樣本中，免疫單細胞轉錄組更豐富(圖1G)。
圖1：肺類癌的單細胞RNA測序。
2.肺類癌的腫瘤間異質性反映了其臨床病理特征和分子亞型
作者進一步對上皮細胞重新進行聚類分析。發現正常細胞簇由不同的患者共享，而腫瘤細胞簇具有高度的患者特異性（圖 2A）。在正常細胞簇中，使用典型標記基因和預定義的基因特征，作者鑒定了 1 型和 2 型肺泡上皮細胞、纖毛細胞、棒狀細胞和基底細胞（圖 2A、B）。作者還在患者之間的腫瘤細胞中發現了許多差異表達的基因（圖 2C），如 CD44、TFF3 和 EGFR，通過免疫組化實驗發現它們與差異蛋白表達相關（圖2D）。為了進一步探索患者間的異質性，作者從單細胞基因表達譜中推斷出不同的功能特征，即細胞周期階段、線粒體讀數的比例和信號通路活性。患者 2 的腫瘤細胞在 S 期的細胞比例最高，同時在免疫組織化學中顯示出最高的 Ki67 增殖指數（圖 2E）。在患者 3 的腫瘤細胞中觀察到最高比例的線粒體讀數，其特征是局灶性腫瘤壞死（圖 2F）。患者 3 的腫瘤細胞轉錄組在 EGFR 通路的活性得分很高，并且在蛋白質水平上有較強的 EGFR 表達（圖 2D，G）。雌激素和雄激素受體信號通路活性評分與患者性別相關（圖 2G；臨床特征見圖 1A）。最近，已經表明，基于轉錄和表觀遺傳特征，肺類癌可以分為三個不同的分子簇。 在本項研究的單細胞基因表達譜中，作者將患者 2 和 3 的腫瘤分配到集群 A1，將患者 1 的腫瘤分配到集群 A2 和集群 B（圖 2H）。值得注意的是，免疫和基質細胞區室僅表現出較小的分子簇基因特征表達分數。總之，肺類癌單細胞轉錄組顯示出腫瘤間異質性，并且反映了不同的臨床和組織形態學特征，例如患者的性別、腫瘤增殖活性和腫瘤壞死，以及最近提出的肺類癌的分子簇等。
圖2：肺類癌腫瘤細胞的腫瘤間異質性。
3.肺類癌的免疫微環境以非炎癥性單核細胞來源的髓樣細胞為特征
作者使用典型標記基因和預定義的基因特征，將免疫單細胞轉錄組進行亞組化并重新聚類（圖 3A、B），并鑒定了不同的淋巴細胞，例如常規 T 細胞、CD8+ T 細胞、NK 細胞、B 細胞和漿細胞（圖 3A）。平均而言，腫瘤組織中淋巴細胞類型的比例與正常組織非常相似，同時還注意到腫瘤和正常組織中的一些患者間異質性（圖 3C）。總之，肺類癌的淋巴微環境類似于正常肺實質的淋巴細胞室。在骨髓細胞室中，作者在腫瘤和正常組織中鑒定出具有不同豐度的單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和肥大細胞（圖 3A）。在單核細胞中，經典的單核細胞簇 2 在腫瘤組織中富集（圖 3D）。常規樹突狀細胞由兩個簇組成，其中 CD141+ 簇 1 主要存在于腫瘤組織中（圖 3E）。雖然單核細胞和常規樹突狀細胞的比例在腫瘤與正常組織中的患者中異質性增加，但在所分析的所有三種類癌中，單核細胞來源的骨髓細胞均持續增加（P = 0.007）。單核細胞衍生的骨髓細胞的進一步特征是 SELENOP、C1QA、C1QB、C1QC 和趨化因子 CCL3 和 CCL4 的高表達（圖 3F）。與正常組織相比，腫瘤組織中單核細胞衍生的骨髓細胞顯示出與炎癥和免疫反應相關的各種基因特征的表達分數略低（圖 3G）。這一部分的分析結果表明，肺類癌免疫微環境主要由非炎癥性單核細胞衍生的骨髓細胞主導。單細胞 RNA 測序分析的三種肺類癌的骨髓細胞室的組成在某種程度上是異質的。
圖3：肺類癌中免疫腫瘤微環境的組成。
4.血管細胞和CAF樣肌成纖維細胞構成了肺類癌的基質微環境
為了深入了解基質微環境的組成，作者使用典型標記基因和預定義的基因特征鑒定了不同的內皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞簇（圖 4A、B）。在內皮細胞中，作者根據預定義的標記基因特征區分支氣管、毛細血管、動脈和靜脈內皮細胞（圖 4A）。雖然正常肺實質中存在不同亞型的內皮細胞，但腫瘤組織中支氣管型內皮細胞顯著富集（P =0 .007）（圖 4A）。作者還發現肌成纖維細胞在腫瘤組織中高度富集 (P = 0.0074)，并表現出高表達的細胞外基質成分，如 COL1A1、COL3A1 和 COL6A3，以及基質降解酶，如 SULF1（圖 4C），表明這些細胞可能參與細胞外基質重塑。此外，肌成纖維細胞的特征在于 TGFβ 信號傳導通路的高活性（圖 4D）。在肌成纖維細胞中，與肌成纖維細胞簇 2 ，其他成纖維細胞和平滑肌細胞簇相比，簇 1 顯示 FAP 和 MMP11 的過表達以及各種膠原蛋白的較高表達（圖 4E）。總之，這些數據表明肺類癌腫瘤組織中的肌成纖維細胞表現出癌癥相關成纖維細胞的生物學特征。類癌的基質微環境以血管平滑肌細胞 (P = .0160) 和周細胞為主。同時，作者還發現腫瘤組織中的周細胞顯示出高表達的 RGS5（一種參與周細胞發育的基因）和 ACTA2（一種平滑肌標記基因）（圖 4F）。我們發現這些基因以分級方式表達，這表明腫瘤組織中的周細胞和血管平滑肌細胞形成一個連續體，而不是離散的細胞類型（圖 4G）。
圖4：肺類癌的間質腫瘤微環境的組成。
5.腫瘤微環境細胞之間的相互作用可能激活NOTCH、VEGF、TGFβ和JAK/STAT信號
接下來，作者觀察到不同的細胞類型在肺類癌微環境中特別富集（圖 5A）。為了描繪微環境和腫瘤細胞之間的功能關系，作者量化了潛在的旁分泌受體-配體相互作用。在基質微環境的細胞類型之間發現了大多數潛在的相互作用，包括腫瘤相關的內皮細胞、肌成纖維細胞、血管平滑肌細胞和周細胞，而腫瘤細胞較少參與潛在的旁分泌相互作用（圖 5B)。此外，作者發現許多相互作用可能激活 NOTCH、TGFβ、VEGF 和 JAK/STAT 信號（圖 5C）。腫瘤相關內皮細胞接收潛在的 VEGF、TGFβ 和 NOTCH 通路激活信號，而肌成纖維細胞主要通過各種旁分泌和自分泌相互作用接收潛在的 TGFβ 通路激活信號。樹突狀細胞、單核細胞和單核細胞衍生的骨髓細胞主要通過與其他免疫細胞的自分泌和旁分泌相互作用接收潛在的 JAK/STAT 通路激活信號。這些結果表明，各種基質細胞和免疫細胞之間的自分泌和旁分泌相互作用可能會塑造肺類癌腫瘤的微環境。
圖5：肺類癌微環境中潛在的旁分泌作用。
三、總結
這篇文章首次全面探究了肺類癌的細胞組成成分，揭示了其腫瘤微環境的非炎癥性和富含血管的特性，并概述了相關的細胞間相互作用，這些發現可能作為未來的治療方向。
參考文獻
1. Bischoff, P., Trinks, A., Wiederspahn, J., Obermayer, B., Pett, J.P., Jurmeister, P., Elsner, A., Dziodzio, T., Ruckert, J.C., Neudecker, J. et al. (2022) The single-cell transcriptional landscape of lung carcinoid tumors. Int J Cancer, 150, 2058-2071.
