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導讀
據2020年全球癌癥統計數據，胃癌（GC）已經成為最常見的癌癥類型之一，是全球范圍內第四大癌癥相關死亡原因。晚期胃癌患者預后不良，中位生存期短于1年。因此，還需要開發新型藥物來延長胃癌患者的總生存期。盡管免疫治療是大部分胃癌患者的首選，但是胃癌異質性阻礙了開發新型藥物的腳步。近年來，單細胞RNA測序（scRNA-seq）廣泛用于研究各種癌癥類型腫瘤內和腫瘤見異質性并揭示了炎癥，癌前病變和胃癌的單細胞特征。scRNA-seq可以用于分析異質和功能亞群，對胃癌的異質性研究提供重要價值。下面，小編就為大家介紹幾篇近年來應用scRNA-seq數據研究胃癌的文章。
案例一：單細胞測序研究胃癌患者的成纖維細胞
腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）的活性可以作為治療癌癥的潛在治療靶點。然而，胃癌中CAF的異質性尚不清楚。這篇文章作者通過對8例GC樣本和鄰近黏膜（AM）樣本進行scRNA-seq。分析CAF亞群的特征及其CAF亞群調控的腫瘤微環境（TME）組分之間的動態通訊。
scRNA-seq揭示癌癥相關成纖維細胞亞群與胃癌患者的不良臨床結局
作者對8例胃癌樣本和鄰近黏膜樣本進行scRNA-seq，共獲得36897個細胞，聚為23個細胞簇，注釋為7類細胞，分別為上皮細胞，內皮細胞，成纖維細胞，T細胞，B細胞，巨噬細胞和肥大細胞。
腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）具有促進腫瘤進展的多種作用，是腫瘤微環境的重要組分。基于特異性細胞標志物的表達，作者鑒定到4個成纖維細胞亞群，分別為及纖維母細胞，周細胞，細胞外基質CAFs（eCAFs）和免疫調節CAFs（iCAFs）。對4個CAFs亞群的差異分析和富集分析表明4個CAFs亞群具有不同的作用。其中，肌成纖維細胞中高表達基因富集于肌肉收縮，血管平滑肌細胞增殖和血管發育。周細胞中上調基因富集于血管發育。腫瘤來源的iCAFs上調基因與炎癥反應的調節有關。說明這些細胞在與免疫細胞交流中發揮作用。此外，作者發現了一類以POSTN高表達為特征的CAF亞群，該基因編碼蛋白支持上皮細胞黏附和遷移并促進腫瘤干細胞維持和轉移。作者將這類細胞定義為細胞外基質CAFs（eCAFs）。eCAFs中具有腫瘤侵襲相關基因高表達，說明eCAFs是腫瘤轉移的TME重要組分。KM分析表明，POSTN高表達的患者總生存期較短。總的來說，eCAFs是CAF的重要亞群，具有促進腫瘤轉移和影響患者預后的作用。免疫組化結果表明，iCAFs富集在腫瘤腺體內和淋巴結樣結節中，說明他們可能參與調節淋巴細胞。eCAFs分布于遠端間質區域。
案例二：單細胞測序研究胃癌患者多種細胞亞型異質性
腫瘤微環境（TME）由多種細胞類型和細胞外組分組成，他們圍繞在腫瘤細胞周圍，由血管網絡滋養。TME中的細胞異質性及其復雜，使用scRNAseq可以在單細胞分辨率下研究各種惡性細胞和非轉化細胞類型。這篇文章作者使用scRNAseq研究胃癌中免疫抑制微環境和特異性細胞類型間的相互作用，通過對9例非轉移性胃癌樣本和正常樣本進行scRNAseq鑒定TME中不同亞群的免疫細胞和基質細胞的基因表達變化并構建胃癌的細胞相互作用網絡。
單細胞景觀揭示活性細胞亞型及其在胃癌腫瘤微環境中的相互作用
作者對9例非轉移性胃癌樣本和正常樣本進行scRNAseq，共獲得47304個細胞，17個細胞簇注釋為7種細胞類型，包括T細胞和NK細胞，B細胞，髓系細胞，肥大細胞，成纖維細，內皮細胞，上皮細胞和惡性細胞。
首先，作者對T細胞和NK細胞進行重聚類共得到14個亞群，主要包括調節性T細胞，CD4+ T細胞，CD8+ T細胞，自然殺傷細胞和先天淋巴細胞。腫瘤樣本中Treg的比例高于正常樣本，說明Tregs在腫瘤樣本中募集。TCGA數據集結果表明Treg的特征基因在腫瘤樣本中高表達。腫瘤樣本中的Tregs與免疫抑制相關的多個基因高表達。GSVA分析表明IL2-STAT5信號通路，IL6-JAK-STAT3信號通路和PI3L-AKT-MTOR信號通路等在腫瘤樣本中上調。以上結果表明胃癌微環境具有免疫抑制作用。
接下來，作者對髓系細胞進行重聚類共獲得15個亞群，其中M01-M03為單核細胞，M04-M07為樹突狀細胞，M08-M11為巨噬細胞，M12,M13和M15為低質量細胞。M04中CD1C，FCER1A和CLEC9A高表達，M05中CLEC9A高表達，M07中LILRA4高表達，M06種LAMP3，CCL22和CCL19高表達。M06亞型中的細胞均來自腫瘤樣本，說明LAMP3+ DC亞型在腫瘤樣本中富集。TCGA數據集分析表明LAMP3+ DC亞型的特征基因在腫瘤樣本中高表達。樹狀圖表明，LAMP3+ DC與cDC1和cDC2簇均到一起。軌跡分析表明，LAMP3+ DC可以來自于胃癌的cDC2和cDC1。SCENIC分析表明，在LMAP3+ DC中，IRF1,IRF2,NFKB1和NFKB2活性上調，說明IRF家族和NF-kB是DC分化和成熟的關鍵調控因子。
對于巨噬細胞來說，M08中INHBA，PTGS2和促炎細胞因子和趨化因子高表達。M09和M10種C1Q多個基因和抗原提呈基因高表達。M11中多種干擾素誘導基因高表達。M08為腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）。巨噬細胞可分為促炎M1和抗炎M2類。M08和M11中M1特征基因高表達，M9和M10中M2特征基因高表達。對TAMs和C1QC+巨噬細胞的基因表達水平分析鑒定到49個上調基因。GSVA分析表明TAMs中WNT β catenin信號，血管生成和上皮間質轉化活性增加，而C1QC+ 巨噬細胞在MHC Ⅱ類抗原呈遞中上調。
3467個成纖維細胞聚為11個細胞亞群。其中F01為周細胞，F01在腫瘤樣本中的豐度較高，免疫熒光染色表明周細胞位于血管周圍，血管生成因子在F01種表達水平升高，說明F01在胃癌的新生血管中起到關鍵作用。F03為正常組織中的成纖維細胞亞群，其表達特征與人類結腸間充質細胞S2亞群類似，可能在維持上皮內穩態中發揮作用，然而腫瘤組織中F03亞群較少，說明腫瘤中上皮屏障的功能障礙。F06來源于正常組織，CFD，CLU，COL14A1和PI16高表達，該簇是多種組織中的成纖維細胞亞型。此外，多個補體因子在F06種高表達，說明F06在先天免疫防御中發揮作用。F04，F05和F08富集于腫瘤樣本，為癌癥相關成纖維細胞。CTHRC1在F04中高表達，CTHRC1與多種腫瘤的進展有關，免疫熒光染色表明CTHRC1+細胞位于腫瘤組織的內皮細胞周圍。TCGA數據集分析表明高表達Fib-CTHRC1的特征基因預后較差。F05為COL14A1+成纖維細胞簇，其中C7和APOD高表達，MMP1，MMP3和MMP9在F08種高表達。
1873個內皮細胞聚為9個細胞亞群。其中E01為尖端樣細胞，ESM1，KDR和PDGFB高表達。TCGA數據集分析表明E01中的特征基因在胃癌組織中高表達，說明胃癌中血管生成非常活躍。E02和E03種ACKR1和SELP高表達。免疫熒光染色表明ACKR1在腫瘤的ECs中高表達。TCGA數據集中ACKR1高表達患者的預后較差。E04中CD36和CA4高表達，代表毛細血管內皮細胞。E05中多種動脈ECs標志物高表達。E07中多個干擾素誘導基因高表達。E09種LYVE1和CCL21高表達。
最后，作者使用CellPhoneDB2研究細胞-細胞相互作用。正常組織中，髓系細胞的相互作用較多。而在腫瘤組織中，內皮細胞與纖維細胞，單核細胞，巨噬細胞和DC存在相互作用。EC-ESM1與四個成纖維細胞亞群具有較強的相互作用。總的來說，內皮細胞和纖維細胞相互作用的增強是胃癌細胞-細胞相互作用的根本變化。
案例三：單細胞測序研究胃癌不同轉移器官的細胞異質性
在胃癌治療中最困難的問題主要在于手術治療效果不好和向不同器官轉移。淋巴結，肝臟，腹膜，肺，骨和卵巢是常見的靶部位。腫瘤細胞可通過血液，淋巴細胞和腹腔內擴散侵襲遠處部位。腫瘤細胞會通過激活特定的基因和通路并向特定器官表現出趨向性，而腫瘤招募的免疫細胞和宿主微環境在促進轉移進展中也起著重要作用。因此，器官特異性轉移特征的精確定位十分重要。然而，GC向不同器官轉移的特征還十分不清楚。這篇文章，作者使用scRNAseq研究胃癌的原發腫瘤和不同器官轉移研究癌細胞和TME在腫瘤內和腫瘤間的異質性以及不同器官轉移模式。
scRNA-seq揭示人類胃癌器官特異性轉移的轉錄異質性
作者對10例胃癌組織，包括3例原發組織（PT），1例正常組織（NT）和6個轉移灶（M）（肝，淋巴結，腹膜，卵巢）進行scRNAseq，共鑒定到42968個基因，包括上皮細胞，基質細胞，增殖細胞，T細胞，B細胞，自然殺傷細胞和髓系細胞。在不同原發組織和轉移灶中，細胞比例差異很大。
首先，作者分析上皮細胞。83%的非惡性上皮細胞來自NT，惡性上皮細胞中的腫瘤特異性基因表達水平較高。對PT和M的惡性上皮細胞進行聚類鑒定到4個亞簇。對G0和其他惡性上皮細胞的DEG進行IPA分析，G0細胞表現出腫瘤血管化和侵襲特征。VEGFA在G0細胞中顯著上調并在ILK通路和IL-8信號通路中激活。G0細胞可能具有血管生成和侵襲性。G1細胞的特征為遷移和EMT，這些細胞更容易通過腹腔內擴散進行轉移。G2細胞主要分布在LN2和PT3中，G2細胞可能是GC中休眠型腫瘤細胞。G3細胞主要分布于PT和M，Li中，G3細胞與GC惡性進展有關。TCGA數據集的KM分析表明，G0，G1和G3相關基因高表達的患者總生存期較差。
接下來，作者分析內皮細胞，共鑒定到3個亞簇。E0的IGFBP5，STC1和IGFBP3在PT和M中而在NT中不表達，其中IGFBP3和STC1影響血管生成發芽。IPA分析表明與腫瘤侵襲GC密切相關的mTOR和IGF-1信號通路在E0細胞中正調控。疾病和生物功能分析表明E0細胞會增加腫瘤細胞的侵襲和遷移，說明E0細胞會促進胃癌侵襲。E1細胞在PT和M中最多，IPA分析表明E1細胞與T細胞衰竭信號通路的調控密切相關。NT中大多數內皮細胞為E2簇，其活性低于其他亞群說明他們是正常的內皮細胞。此外，作者使用TCGA數據集評估E0和E3特征標記對患者生存期的影響，E0基因高表達的患者總生存期較低。
889個成纖維細胞聚為2個亞簇，其中F0是PT和M的原代成纖維細胞，定義為iCAFs，而F1在不同組織中的比例不同，定義為mCAFs。對這兩類細胞中的上調DEGs進行GO分析。mCAFs和iCAFs均富集生物功能細胞外基質/結構組織和細胞基質粘附，而mCAFs富集于肌肉相關過程，iCAFs負疚細胞外基質分解，白細胞遷移調節和血管生成的調控。CCI分析表明，配體受體對CXCL12-CXCR4參與了iCAFs與T細胞，B細胞和髓系細胞的相互作用。此外，iCAF標志基因高表達患者的總生存期較差。
案例四：單細胞測序研究胃癌預后相關基因
脂肪酸結合蛋白（FABPs）是一種高度保守的低分子量的細胞質蛋白。FABP1主要溶解脂肪酸，脂肪酸參與細胞內代謝等信號過程。FABP1蛋白具有經典的β結構折疊和α螺旋。FABP1具有多種功能，包括抗氧化應激的保護劑，參與調節脂肪生成和脂質代謝。FABP1與各種疾病有關，FABP1的表達水平與各種腫瘤發生發展密切相關。這篇文章作者對胃癌的scRNAseq數據進行分析，發現FABP1是GC組織中最顯著差異表達的基因，是GC發展的核心基因并且與GC患者的預后有關。
胃癌scRNAseq揭示FABP1是一種新的預后生物標志物
作者對GSE134520單細胞轉錄組數據集進行分析，得到4110個細胞和3385個基因。tSNE分析和注釋后鑒定到胃細胞，漿細胞樣樹突狀細胞和記憶T細胞。
隨后，作者進行了偽時間分析并對DEGs進行GO和KEGG富集分析。DEGs主要與蛋白靶向，蛋白質定位，中性粒細胞脫粒，細胞-底物鏈接合細胞黏附分子結合等功能有關。KEGG分析表明DEGs主要與氧化磷酸化，內質網中蛋白質加工和TNF信號通路有關。
使用COMPPI數據庫和Cytoscape繪制網絡圖，并給予差異細胞位置篩選網絡中FABP1的靶基因。作者以FABP1為靶點，篩選7個相關蛋白并構建PPI網絡。FABP1與激素敏感脂肪酶介導的三酰甘油水解，脂肪消化和吸收顯著相關。SurvExpress數據集結果表明，FABP1的表達水平對STAD患者的總生存期顯著相關。此外，FABP1表達水平同樣與早期病理診斷的年齡相關。
為了進一步研究FABP1在GC組織中的表達及其預后的關系，作者使用IHC分析FABP1在GC組織中的表達情況。結果表明，FABP1在胃癌組織中表達水平較高。KM分析表明，FABP1高表達與預后較差有關。說明，FABP1在胃癌中具有促進腫瘤發展和預測預后的作用。
總結：
總的來說，得益于單細胞測序技術的發展使研究人員可以從單細胞水平研究腫瘤微環境異質性。小編以以上四篇文章為例介紹了單細胞測序在胃癌研究中的應用。這四篇文章從不同角度研究了胃癌腫瘤微環境和細胞的異質性，分析內容豐富且較為常規，小伙伴們快來學習起來吧~
參考文獻
1. Single-cell RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric cancer
2. Single-cell landscape reveals active cell subtypes and their interaction in the tumor microenvironment of gastric cancer
3. Revealing the transcriptional heterogeneity of organ-specific metastasis in human gastric cancer using single-cell RNA Sequencing
4. Integrated Single-Cell RNA-Sequencing Analysis of Gastric Cancer Identifies FABP1 as a Novel Prognostic Biomarker
