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大家好呀，今天分享的文章題為在單細胞水平表征腫瘤微環境揭示骨肉瘤中一種新的免疫逃逸機制，文章內容扎實詳盡，于今年一月發表在《Bone Research》（IF = 13.362）上，讓我們來一起學習一下吧！

一、摘要

免疫微環境廣泛參與骨肉瘤（Osteosarcoma（OS））的發生和發展。然而，OS中免疫細胞的景觀和動態特征還不清楚。作者通過分析單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據，繪制了OS免疫微環境的圖譜。結果表明，一群調節性樹突狀細胞（DC）可能通過募集調節性T細胞來塑造OS免疫抑制微環境。并且主要組織相容性復合體I類（MHC-I）分子在癌細胞中下調。研究結果表明OS中腫瘤免疫原性降低，這可能是腫瘤免疫逃逸的潛在機制。值得注意的是，CD24被確定為一種新的 ” don’t eat me ” 信號，有助于OS細胞的免疫逃避。總之，我們的研究結果提供了對OS免疫狀況的見解，提示骨髓靶向免疫治療可能是治療OS的一種有前途的方法。

二、結果

1、使用單細胞測序數據分析骨肉瘤腫瘤微環境

在已發表的單細胞數據集（GSE152048）中，有7個原發性腫瘤病變，2個復發性腫瘤病變和2個肺轉移灶。本文納入了scRNA-seq數據，并與來自85例患者的腫瘤組織的大量RNA-seq數據相結合，經過質量控制后（以及消除患者之間的批次效應），鑒定出了8個細胞簇：髓系細胞（LYZ⁺）、淋巴細胞（CD3D⁺）、破骨細胞（ACP5⁺）、內皮細胞（CLDN5⁺）、血管周圍樣細胞（PVL）（RGS5⁺TAGLN^high）、癌相關成纖維細胞（CAFs）（TAGLN^lowACTA2⁺）和增殖細胞（MKI67⁺）。在髓系細胞群中，注釋了巨噬細胞（APOE⁺CD68⁺）、單核細胞（S100A8⁺S100A9⁺）和樹突狀細胞（HLA-DQA1^highCD14^-）。對于淋巴細胞，我們對CD4 T細胞（IL7R⁺）、CD8 T細胞（CD8A⁺）、調節性T細胞（Tregs）（TNFRSF4⁺）、自然殺傷（NK）細胞（GNLY⁺GZMB⁺）和B細胞（CD79A⁺JCHAIN⁺）進行了分類。此外， PDGFRA⁺CXCL12⁺ CAFs被注釋為炎癥性CAFs（iCAFs），而肌成纖維細胞樣CAFs的特征是ACTA2高表達，PDGFRA^-表達（圖1）。

2、腫瘤相關的樹突狀細胞通過招募調節性T細胞促進腫瘤免疫耐受

在OS中有三個樹突狀細胞（DC）亞群，包括傳統的1類樹突狀細胞（cDC1s）（XCR1⁺CLEC9A⁺）和傳統的2類樹突狀細胞（cDC2s）（CD1C⁺CLEC10A⁺）。此外，在OS中發現了一簇CD83⁺CCR7⁺LAMP3⁺樹突狀細胞，可稱為成熟調節樹突狀細胞（mregDc）。為了研究這些mregDCs是否具有腫瘤特異性，作者通過Harmony軟件包從正常外周血單核細胞（PBMC）（GSE94820）和兩個OS隊列（GSE152048和GSE162454）中提取DC細胞，發現mregDCs優先存在于兩個獨立的OS隊列中，但在正常PBMCs中幾乎不存在，表明mregDCs可能是腫瘤相關的DC群體。此外，OS骨髓中CD83⁺CCR7⁺LAMP3⁺樹突狀細胞的數量高于正常骨髓。綜上所述，在OS中存在一組腫瘤特異性樹突狀細胞（圖2）。

在對DC進行重新聚類后，使用來自Seurat v3包的功能來計算從PBMC到OS數據集中識別的不同子集的相似性。結果顯示mregDC和cDC1亞群之間具有相似性。使用Monocle2對DC群體和mregDCs進行擬時序分析，發現OS中的mregDCs可能起源于cDC1，這與之前研究結果一致。此外，輔抑制劑CD274、LAG3、LGALS9、SIRPA、TIGIT和PDCD1LG2均沿分化軌跡上調。與cDC1s和cDC2s相比，mregDCs表現出”激活”表型，具有更高的遷移能力和免疫調節能力，表明該DC亞群是成熟的調節DC。更重要的是，mregDCs特異性表達CCR7、CCL17、CCL19和CCL22，它們可以招募多種浸潤性T細胞。由于目前只包括11例患者，通過計算mregDC和數據庫中T細胞之間的相關性，發現mregDCs與調節性T細胞（Tregs）之間有很強的相關性，同時，作者對腫瘤切片染色發現mregDCs和Tregs物理位置也是相近的。為了研究DC亞群的臨床作用，通過CIBERSORTx估算OS細胞比例，發現mregDC評分與較差的總生存率相關，Tregs的積累與總體生存率負相關。mregDC與Tregs之間呈正相關，表明mregDCs可能通過在OS 腫瘤免疫微環境（TME）中招募Tregs來促進腫瘤免疫耐受（圖3）。

3、癌細胞免疫原性的異質性

拷貝數變異（CNVs）是一種有效的策略來識別更具侵襲性的癌細胞克隆。研究發現，在成軟骨細胞OS病變中積累了更多的典型的CNVs，然而，高CNV是否會導致免疫逃逸尚不清楚。本文檢測了CNV與OS中免疫應答之間的關系。通過整合基質細胞，估計每個細胞的CNV。結果顯示，癌細胞比成纖維細胞積累了更多的CNVs。有趣的是，在基質細胞中觀察到一簇低CNV的癌細胞。轉錄因子和基序分析發現，轉錄因子（TF）基序包括CEBPB（+）、FOSB（+）、FOSB（+）、SAP30（+）和ATF4（+）在高CNV的癌細胞中顯著上調，而IRF3（+）、ETV7（+）、STAT1（+）和IRF7（+）下調，揭示了一種在OS細胞中由TFs驅動的新的調控網絡。此外，MSigDB標志基因集的基因本體論（GO）富集分析和基因集變異分析（GSVA）均顯示，IFN-γ反應在低CNV的癌細胞中富集。由于MHC-I的轉錄下調是損害IFN-γ信號通路抗腫瘤作用的最重要因素之一，隨后作者在mRNA水平上檢測了MHC-I分子的表達，發現CNV水平較高的癌細胞表現出較低水平的MHC-I基因（HLA-A、HLA-B和HLA-E）和B2M基因，這表明這些癌細胞的免疫原性較低。為了進一步研究MHC-I的下調是否在OS中廣泛存在，通過免疫組化（immunohistochemistry）染色評估了OS患者切片中MHC-I和B2M的表達。結果顯示，具有高級別的OS下調了MHC-I和B2M的表達。基于這些發現，在高級別OS中，干擾素信號通路和MHCI類分子的下調可能導致免疫逃逸（圖4）。

4、CD24信號通路調節巨噬細胞介導的OS免疫應答

在多種類型的癌癥中，腫瘤微環境（TME）常常使巨噬細胞分化為促腫瘤表型，OS中大多數巨噬細胞為M2表型（表現出抗炎和促腫瘤作用）。然而，驅動免疫耐受的潛在機制尚未完全了解。癌細胞通過高表達抗吞噬表面蛋白，包括CD47和程序性細胞死亡配體1（由CD274編碼）來逃避免疫細胞的清除。CD24是一種新的 ” don’t eat me ” 信號，可以抑制Toll樣受體介導的炎癥和巨噬細胞的吞噬。CD24和CD47的表達強于CD274，表明在OS中是巨噬細胞介導的免疫逃逸而非T細胞介導的免疫逃逸。并發現CD47在幾乎所有細胞類型中都高表達，而CD24在OS細胞中優先表達。熒光原位雜交（FISH）顯示，CD24在同一患者的OS組織中的mRNA表達高于正常骨髓。此外，發現高CNV癌細胞比低CNV癌細胞和成纖維細胞表達更高的CD24。IHC染色也顯示CD24在高級別OS中有更強的表達。這些結果共同說明了CD24是OS中潛在的免疫治療靶點。

為了研究CD24在OS中通過調節巨噬細胞表型從而調節免疫反應中的作用，用IL-4處理骨髓源性巨噬細胞（BMDMs）生成M2巨噬細胞，并將這些吞噬細胞較少的巨噬細胞與GFP⁺ K7M2骨肉瘤細胞系共培養36 h。通過活細胞顯微鏡觀察，在K7M2細胞系中對Cd24a的干擾增強了吞噬作用。類似地，基于熒光激活細胞分選（FACS）的測量結果顯示，與隨機siRNA相比，轉染Cd24a siRNA后的吞噬作用顯著增加。此外，與Cd24a敲低的癌細胞共培養的BMDMs具有更多的炎癥表型（圖5）。

為了研究下調CD24對吞噬作用的保護是否可以在體內重現，作者用膽固醇修飾的Cd24a siRNA或隨機siRNA治療攜帶骨膜骨肉瘤的小鼠，移植后3周，通過CT掃描檢測發現，與隨機的siRNA組相比，Cd24a siRNA組的腫瘤致瘤性顯著降低。此外，IHC染色顯示，Cd24a siRNA組中MHC-II+細胞和浸潤的CD4 T細胞顯著增加。FACS分析還表明Cd24a siRNA組吞噬作用和抗原呈遞作用的增強。總之，我們的研究結果顯示，OS細胞通過CD24信號通路逃避巨噬細胞介導的免疫應答（圖6）。

5、OS中的細胞互作

通過cellphonedb計算OS中細胞互作為OS TME提供新信息，CD24-SIGLEC10受體對在癌細胞和多個巨噬細胞亞群之間的富集揭示了CD24在OS中的免疫調節作用。此外，SPP1和ITGAV在SPP1⁺ TAMs和CAFs中的超高表達表明，SPP1⁺ TAMs可能通過CAFs中的對齊纖維連接蛋白來促進癌細胞的定向遷移（圖7a）。接下來，通過對DC亞群的異質細胞進行相互作用分析發現，cDC1具有通過CXCL10-CXCR3誘導多種T細胞浸潤的強大能力，而mregDCs通過CD274-PDCD1和PVR-TIGHT與Tregs的相互作用表現出最高的免疫抑制能力，CAFs和SPP1⁺ TAMs通過ACKR3-CXCL12和CCL2/CXCL1-ACCR1軸與內皮細胞相互作用。ACKR家族在OS中的血管生成中起作用。其他配體受體對通過PGRMC2-CCL4L2參與癌細胞和SPP1⁺ TAMs之間的相互作用，以及通過CXCL12-CXCR4參與CAFs和TAMs之間的相互作用；不同病變例如OS樣本有原發性、復發性和轉移性病變的成骨細胞骨肉瘤和成軟骨細胞骨肉瘤組成，由于細胞不處于同一個TME中，所以細胞不能相互作用；根據不同類型OS中細胞相互作用模式，髓系細胞通過與OS中的免疫細胞和基質細胞的相互作用在TME中發揮作用。

三、小結

OS是一種常見的惡性的腫瘤，對于治療也是相當困難，TME廣泛參與腫瘤的發生發展，本文通過數據庫中原有的單細胞數據對OS中細胞進行劃分，并發現了確定了一種新的樹突狀細胞-成熟調節樹突狀細胞，這種樹突狀細胞和Tregs高度相關；并且發現CD24是一種新的 ” don’t eat me ” 信號，可以抑制Toll樣受體介導的炎癥和巨噬細胞吞噬細胞；通過細胞通訊分析發現不同病變類型OS的細胞不能進行細胞互作，這也更加需要個體化治療。本篇文章的亮點在于利用已有的單細胞數據和RNA-seq數據從新的切入點分析OS的TME中細胞的互作，在發現成熟調節性樹突狀細胞時，作者比較了在正常PBMC和OS中成熟調節性樹突狀細胞存在情況，并利用RNA-seq數據計算成熟調節性樹突狀細胞和個體生存的關系是非常新穎的。

參考文獻：Liu W, Hu H, Shao Z, Lv X, Zhang Z, Deng X, Song Q, Han Y, Guo T, Xiong L, Wang B, Zhang Y. Characterizing the tumor microenvironment at the single-cell level reveals a novel immune evasion mechanism in osteosarcoma. Bone Res. 2023 Jan 3;11(1):4. doi: 10.1038/s41413-022-00237-6 . PMID: 36596773 ; PMCID: PMC9810605 .