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大家好呀~今天要給大家分享的是2022 年 5 月發表于《Frontiers in Immunology》（IF：7.561）上的一篇文獻。話不多說，一起來看看吧~
與免疫浸潤和結腸癌治療反應相關的預后程序性細胞死亡相關lncRNA 的特征
程序性細胞死亡 (PCD) 是多種生理環境中必不可少的生物過程，包括胚胎發育、組織穩態的維持和宿主對病原體的免疫防御。細胞凋亡是PCD的傳統模式，主要由線粒體介導的內在途徑和涉及死亡受體的外在途徑組成。細胞焦亡(pyroptosis)是由炎性小體引發的一種細胞程序性死亡，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物釋放進而引起強烈的炎癥反應。細胞焦亡是自然免疫反應的重要組成部分，在對抗感染和惡性腫瘤中發揮重要作用。鐵死亡是一種鐵依賴的細胞死亡，其特征是細胞內活性氧的積累。這一過程依賴于腫瘤微環境中損傷相關分子模式的釋放和由鐵死亡細胞損傷引發的免疫反應。調控鐵死亡可以抑制多種癌癥的細胞遷移、侵襲和增殖。
簡要概括版
篩選具有預后價值的PCD 相關 lncRNA構建預后模型并加以驗證，最后挑選出特定的重要基因進行實驗驗證。
詳細介紹版
研究人員首先在TCGA中下載結腸癌患者的轉錄組測序數據和臨床信息，并利用GENCODE 數據庫中的 lncRNA 注釋文件進行注釋，基于相關系數 > 0.3 和 p < 0.05 的 Spearman 相關分析篩選 TCGA-結腸腺癌 (COAD) 數據中的 PCD 相關 lncRNA，根據聚類分析結果將患者分組。然后使用單因素Cox 回歸分析篩選具有預后價值的 lncRNA，篩選出八個與 PCD 相關的 lncRNA 用于構建預后模型，利用公共數據和臨床數據對該模型的準確性和有效性進行驗證，并對高危組和低危組患者的表觀遺傳修飾和免疫細胞浸潤變化進行探究。最后通過體外和體內實驗驗證 lncRNA U62317.4 的致癌作用。
1. 基于 PCD 相關 lncRNA識別預后不同的結腸癌患者分組
根據已發表文獻，共有199 個與 PCD 相關的基因：33個與細胞凋亡相關，52 個與細胞焦亡相關以及 114與鐵死亡相關。圖 2A-C結果顯示，大多數 PCD 相關基因的表達在結腸癌和正常組織之間存在顯著差異。研究人員通過相關性分析篩選出與這些基因表達最密切相關的 lncRNA，在 437 個 PCD 相關 lncRNA 中，與細胞焦亡、細胞凋亡和鐵死亡相關的lncRNA分別是85、161 和 297 個（圖 2D-F）。利用單變量 Cox 分析篩選出41 個 PCD 預后相關的 lncRNA（圖3A、B）。圖 3C差異分析顯示，這些 lncRNA 的表達在腫瘤和正常組織之間存在顯著差異。結合共識矩陣累積分布函數曲線和 delta 面積圖，研究人員選取K = 2并基于上述 lncRNA 的表達對結腸癌樣本進行共識聚類分析。KM生存曲線顯示，cluster 1 的 OS 率顯著優于cluster 2（圖 3D-G）。在臨床特征上，cluster 1 中的T 分期、淋巴轉移和腫瘤分期等級更高（圖3H）。
2. 結腸癌亞群的生物學功能分析
為進一步探究不同亞群之間預后差異的內在原因，研究人員對不同亞群中的 DEGs進行GSEA、GO 和 KEGG 分析。GSEA結果顯示，免疫相關B細胞受體、趨化因子、JAK-STAT、T 細胞受體和 Toll 樣受體信號通路在cluster 1 中異常激活（圖 4A）。與 GSEA 結果一致，GO 結果顯示DEG 參與免疫相關功能（圖 4B-D）。圖 4E中KEGG 分析顯示，DEGs主要與信號通路相關的細胞生長、趨化因子、細胞因子和吞噬體相關。
3. cluster 1 和cluster 2腫瘤免疫微環境和免疫檢查點分析
上述分析顯示，不同亞群之間的DEGs主要與免疫相關功能有關，于是研究人員進一步對結腸癌免疫微環境中的免疫細胞分布進行分析。圖 5A結果顯示，cluster 1 和cluster 2的免疫細胞浸潤量顯著不同。cluster 1中的記憶 CD4 T 細胞和嗜酸性粒細胞數量豐富，而cluster 2中有更多的濾泡輔助 T 細胞和靜息自然殺傷 (NK) 細胞（圖 5B-E）。圖 5F-H結果顯示，cluster 2的免疫、基質和ESTIMAT分數顯著低于cluster 1。圖 5I中的結果顯示cluster 2中的免疫功能完全受到抑制。考慮到免疫檢查點在免疫治療中的重要性，研究人員又對兩個亞群中免疫檢查點的表達進行分析，發現除TNF受體超家族成員 (TNFRSF) 25 和 14 之外的所有免疫檢查點基因在cluster 2 中均受到顯著抑制（圖 5J）。因此，研究人員推測該亞群中患者的較低 OS 率可能是由于免疫功能受到抑制。
4. 構建PCD 相關 lncRNA 預后模型
研究人員篩選出八個基因（AC004080.1, AC078923.1, AC114730.3, AC156455.1，LINC01419, LINC00997, NKILA和U62317.4）用于構建預后模型，并根據這八個基因的回歸系數和表達計算風險評分（圖 6A-C）。為測試模型的準確性和有效性，研究人員將患者隨機分為訓練組（N = 260）和測試組（N = 176），然后根據中位風險評分將其分為高風險組和低風險組。生存分析結果顯示，訓練組高風險評分患者的 OS 比低風險評分患者更差（圖 6D），高風險評分患者的死亡率顯著高于低風險評分患者（圖 6G）。圖 6J 中ROC 曲線顯示，預后模型可準確預測 CC 患者的 1、3 和 5 年生存率。該模型的準確性在測試組（圖 6E、H、K）和整個 TCGA 數據集（圖 6F、I、L）中也得到了驗證。
5. 預后模型的獨立因素和臨床病理學相關性分析
接下來，研究人員通過單因素和多因素Cox 分析進一步證實預后模型的獨立性。圖 7A和B 結果顯示年齡和風險評分是結腸癌患者的獨立預后因素。圖 7C結果顯示高風險組中所有八種 PCD 相關 lncRNA 的表達顯著增加。隨后，研究人員構建了一個列線圖，其中包括患者年齡、性別、腫瘤分期、遠處轉移、淋巴結轉移和風險評分，以準確量化生存率（圖 7D）。校準曲線、ROC 曲線下面積和DCA 決策曲線結果顯示該列線圖可有效評估患者的預后（圖7E-L）。
6. 高危和低危人群的功能富集和免疫細胞浸潤水平分析
圖 8A 為基于 TIMNER、CIBERSORT、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL 和 EPIC 算法的免疫浸潤熱圖。免疫功能差異分析顯示，Apcin (APC)協同抑制、 APC 協同刺激、檢查點、細胞溶解活性、促炎作用、 MHC I 類、 t 細胞協同抑制和 t 細胞協同刺激在高、低風險組間差異顯著。說明八種 PCD 相關 lncRNA 預后特征與免疫細胞浸潤具有相關性。
7. 風險評分與 TMB 和基因 CNVs 的相關性
圖 8C 結果顯示，高風險評分患者的 TMB 水平低于低風險評分患者。進一步的相關分析表明，風險評分與 TMB 呈負相關（圖 8D）。然后研究人員根據中位 TMB 將患者分為 TMB 高、低兩組。生存分析結果顯示，高 TMB 患者的 OS 率顯著低于低 TMB 患者（圖 8E）。此外，研究人員還評估了高風險和低風險組的體細胞突變情況，瀑布圖顯示的是突變頻率最高的前 20 個基因（圖 8G、H）。高風險組和低風險組之間差異最大的前 40 個基因的 CNVs 分析顯示，高風險組和低風險組之間的 DEGs 中 CNVs 突變頻率更高（圖 8I-J）。
8. 免疫療法對高危和低危人群的益處
接下來，研究人員利用網站工具（http://tide.dfci.harvard.edu/）對免疫療法在高風險和低風險人群中的療效進行了評估。較高的腫瘤免疫功能障礙和排斥 (TIDE) 評分意味著免疫逃逸的可能性較高，表明患者從免疫治療中獲益較低。圖 8K結果顯示，高風險組患者的 TIDE 評分顯著高于低風險組患者。高風險組患者的微衛星不穩定性 (MSI) 評分較低（圖 8L），而低風險組患者的 T 細胞排除評分較高（圖 8M）。兩組之間的 T 細胞功能障礙無顯著差異（圖 8N）。
9. 高風險和低風險人群的藥物敏感性潛力分析
研究人員進一步預測了高危和低危人群對結腸癌患者常用藥物的敏感性。圖 9A-F 結果顯示，低風險評分組對PD.0325901、METFORMIN、MK.2206、AZD8055、PD.0332991和索拉非尼更敏感，而高風險評分組對伊馬替尼、拉帕替尼、PHA.665752和 MS.275更敏感（圖 9G-J）。此外，研究人員還通過 CMAP 數據庫確定了可用于高危組患者的四種化療藥物的 3D 結構（圖 9K-N）。
10. PCD 相關 lncRNA風險模型預后價值的驗證
研究人員在臨床收集了96 名結腸癌患者作為外部驗證數據集，并通過 RT-qPCR 檢測8 個 PCD 相關 lncRNA 在結腸癌和鄰近組織中的表達，表達趨勢與TCGA 中的趨勢一致（圖 10A）。根據患者的風險評分中位數將患者分為高危組和低危組。生存分析結果顯示，高風險組的 OS 顯著低于低風險組（圖 10B）。AUC顯示該風險模型可以預測結腸癌患者的結果（圖 10C）。此外，臨床特征和風險評分的單因素和多因素Cox 回歸分析顯示風險評分、分期和年齡是獨立的預后因素（圖 10D、E）。
11. 沉默 U62317.4 可抑制結腸癌的增殖、侵襲和遷移
研究發現lncRNA U62317.4在預后模型中具有最高風險系數，說明U62317.4與結腸癌患者的預后密切相關，所以研究人員進一步探討了 U62317.4 是否參與結腸癌的惡性進展。實驗結果顯示，用 si-U62317.4 轉染后，U62317.4 在 HCT-116 和 SW480 細胞中的表達顯著降低（圖 11A、B）。沉默 U62317.4 可顯著抑制細胞活力和克隆形成（圖 11C-E）并促進細胞的凋亡（圖 11F、G）。此外，敲除 U62317.4 可顯著降低傷口愈合能力以及細胞的遷移和侵襲能力（圖 11H、J）。為評估 U62317.4 在體內的致瘤性，研究人員構建了裸鼠皮下腫瘤模型，結果顯示沉默 U62317.4可顯著抑制這些小鼠中結腸癌的發展（圖 11K-M）。
本文作者在TCGA中通過共表達分析篩選出 41 個預后 PCD 相關 lncRNA，并根據聚類分析結果將結腸癌患者分組。開發了一個包含 8 個 PCD 相關 lncRNA 的預后模型，發現具有高風險評分的患者預后較差，并且預后模型具有較高的診斷能力。作者最后還通過濕實驗進一步驗證了U62317.4 lncRNA 在體內和體外的作用，發現沉默U62317.4 lncRNA可抑制腫瘤增殖和侵襲，促進腫瘤凋亡。
參考文獻
Y. Chen, Y. Zhang, J. Lu et al. Characteristics of Prognostic Programmed Cell Death–Related Long Noncoding RNAs Associated With Immune Infiltration and Therapeutic Responses to Colon Cancer. Frontiers in Immunology, 2022, 13
