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基因編輯系統是基于古細菌抵御外源核酸入侵的免疫機制為基礎開發出來的一種新型的基因編輯技術。相對于傳統的基因編輯技術(sRNAi等)，該技術具有更加高效、操作簡單、細胞毒性小等特點。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術已在腫瘤研究的諸多方面中得到應用，如腫瘤相關基因的功能、構建動物腫瘤模型、篩選腫瘤細胞表型及耐藥相關基因以及腫瘤的基因治療等諸多方面。
隨著技術的進步，描繪不同組織在空間結構上的細胞異質性和發育動態，是腫瘤研究的一個新方向。每個細胞都和臨近細胞有著相似的轉錄組或基因組特征，但多細胞排列在一起，卻能闡述復雜多變的時空模式。
這里，我們介紹新發在Cell的一篇文章《Spatial CRISPR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment》[IF:66]，作者開發了一種新的空間功能基因組學算法——Perturb-map，用于在小鼠的肺癌模型中敲除基因，同時評估每個基因敲除后如何影響腫瘤生長、組織病理學和免疫成分。同時，將Perturb-map和空間轉錄組學配對，以對 CRISPR 編輯的腫瘤進行無偏分析。
一、背景
空間分辨率的單細胞和區域測序表明，遺傳上不同的亞克隆，可能存在于腫瘤臨近，并且可以具有不同的腫瘤微環境；然而，特殊基因是如何影響腫瘤微環境的？鄰近的克隆是怎么影響其他克隆的，這些問題尚沒有確切的定義。雖然已經確定了一些參與協調腫瘤微環境的基因，但許多基因在影響不同腫瘤的結構和免疫組成方面的潛在作用尚未確定。
識別控制細胞排列的基因是一項挑戰，腫瘤微環境的組成是復雜的，許多不同類型的免疫和非免疫細胞的比例、位置、運動都是相互依賴的因素。很多基因的功能是依賴于組織背景以及與特定細胞類型和結構的空間鄰近性。因此，確定腫瘤中表達的數百個基因中的哪一個會影響腫瘤微環境(TME)的組成和分布，需要進行體內研究。
為了擴大基因功能的研究，pooled CRISPR篩選越來越多的用于單細胞測序方法【Fig.S1】，如Perturb-seq；高維細胞術通過更全面地測量由基因擾動引起的分子和表型變化，進一步推進了CRISPR篩選。
Ref：Shalem O, Sanjana NE, Zhang F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nat Rev Genet. 2015 May
然而，雖然pooled篩選方法可以實現高通量，但現有技術在體內研究方面存在局限性。如，分離組織進行分析。這在很大程度上限制了可以通過pooled篩選探測到的細胞內在過程的生物學功能，因為一旦組織均質化，就無法評估基因擾動的細胞外效應。
這里，作者描述了一種體內的空間功能基因組的方法，叫做Perturb-map。該方法基于一種蛋白質barcode系統——Pro-Code，使用少量線性表位的三聯體組合，創建一組更高階的獨特barcode，標記表達不同的CRISPR gRNA細胞。因此該方法可以在單細胞分辨率和組織規模的腫瘤內檢測到120種不同的Pro-Code表達的癌細胞群。作者在肺癌小鼠模型中使用Perbturb-map并行敲除35個基因，同時評估每個基因敲除后如何影響腫瘤生物學的關鍵參數，如生長、組織病理學、免疫組成和分子狀態。
二、數據和代碼
數據：
代碼：https://github.com/srose89/PERTURB-map
三、Highlights
四、結果
1.通過多重成像原位檢測肺和乳腺腫瘤中的 120 個 Pro-Code 群體
在先前的研究中，作者描述一個基于蛋白質的細胞bar-coding系統——Pro-Codes。該系統由支架蛋白、dNGFR融合的線性表位的三聯體組合組成。由于ProCodes可以被抗體檢測到，作者假設可以通過成像來解決。為了測試這一點，生成表達Pro-Codes的癌癥線。使用一組編碼84或120個不同Pro-Codes的慢病毒載體 (LV) 轉導小鼠的肺癌細胞 (KP細胞系) 和乳腺癌細胞 (4T1細胞系) 。
然后，作者在小鼠靜脈中注射KP細胞，或者在乳腺脂肪墊中注射4T1細胞。經過兩周后，在注射4T1細胞的搜集負瘤組織；4周之后，在注射KP細胞的小鼠中收集負瘤組織。使用之前開發的用于高維成像的方法——MICSSS(單張載玻片上的多重免疫組織化學連續染色)，對每個 Pro-Code 表位進行染色?；蛘?，在組織切片在多路離子束成像 (MIBI) 上成像。
這兩種技術都可以在亞細胞分辨率下有效地檢測每個表位，因為可以檢測細胞膜上的表位，正如膜定位 dNGFR 支架所預期的那樣。 因此，能夠在空間上解析乳房[Fig.1ab]和肺[Fig.1c]腫瘤模型中的多達120個Pro-Code。
利用核定位mCherry熒光蛋白作為支架創建了一組新的165個Pro-Codes，證實了CyTOF對每個核Pro-Code(nPC)的檢測。接下來，作者使用120個nPC轉導4T1和KP細胞，重復上述實驗。結果表明，能夠在肺和乳腺腫瘤模型中檢測到120個獨特的nPC中的每一個，并發現它們定位于細胞核[Fig.2a]。
由于膜結合的Pro-Codes(memPC)和核Pro-Code(nPC)具有不同的亞細胞定位，作者假設可以在相同的細胞中組合使用它們。使用56 個memPC的庫轉導4T1，對dNGFR+細胞進行分類，然后使用相同的56個nPC庫再次轉導。作者發現，相同細胞中，可以在細胞核和細胞膜上識別不同的ProCode。
2.Pro-Code 成像顯示KP肺和4T1乳腺腫瘤的克隆性
通過對兩種腫瘤類型的Pro-Codes進行成像，確定了一個非常明顯的差異——與 KP 肺癌相比，4T1腫瘤呈高度異質化分布。肺癌中，幾乎所有的腫瘤病灶都是克隆性的。這暗示著每個KP腫瘤病灶都是由單個KP癌細胞引發的。
為了進一步分析克隆動力學，作者在細胞分割、Pro-Code分配和2D數字重建后，評估4T1原發性腫瘤和KP腫瘤病灶內Pro-Code群體之間的共定位。對于每對 Pro-Code 群體，相對于細胞標簽的隨機交換，基于觀測到的相鄰的相互作用的數量，計算一個Z-score。 Zscore證實KP腫瘤是高度克隆的，因為每個Pro-Code群體都表現出相對頻繁的同型相互作用[Fig.2b]。盡管4T1細胞似乎是隨機分布的，但共定位分析也顯示出一定程度的克隆性。
為了解區域聚集是如何形成的，作者使用核密度估計來可視化Pro-Code陽性細胞的相對區域豐度[Fig.2cd]。接下來，使用Pro-Code來評估4T1轉移的克隆異質性。將nPC-4T1注射到乳腺脂肪墊中以產生乳腺腫瘤。四周之后，為了允許肺轉移，收集Pro-Codes的肺和染色切片[Fig.2e]。
結果發現，對于單個Pro-Code，許多轉移灶是同質的，表明它們起源于原發腫瘤的單個細胞。 然而肺中也存在包含Pro-Code表達細胞混合物的轉移性病灶，這表明多細胞接種或克隆的初始接種隨后是額外的轉移細胞。
作者比較KP肺、乳腺4T1和肺中4T1轉移細胞的克隆異質性[Fig.2f]。證實了每種腫瘤背景的不同空間模式，KP肺腫瘤具有高克隆性和低混合性，4T1原發性腫瘤具有彌漫性克隆性，肺中的4T1轉移瘤呈克隆性發展，但相互作用密度也具有雙峰模式，反映了混合轉移的存在。
3.Perturb-Map確定了對免疫編輯和腫瘤結構敏感性的調節因子
CRISPR篩選幫助確定了一些與癌癥免疫有關的基因，但如前所述，目前的方法不適合研究腫瘤免疫學的許多關鍵方面，例如免疫細胞募集和排除。這里，作者嘗試使用Pro-Codes創建一個用于原位解析CRISPR篩選的平臺。
作者構建了一個nPC/CRISPR慢病毒載體庫，靶向35個基因，包括編碼細胞因子信號通路的調節因子；參與免疫細胞相互作用的配體和分泌因子等[Fig.3a]。雖然，已知這些基因具有免疫功能，但它們在肺的腫瘤微環境生物學中的作用尚未完全確定。 作為對照，靶向KP細胞不表達的F8基因。 對于35個基因，使用三種不同的慢病毒轉導KP-Cas9，每個載體表達相同的nPC，但不同的gRNA靶向相同的基因。通過CyTOF對文庫中特定CRISPR的直接或下游靶標的表型分析，表明有效敲除了同源基因。
CRISPR-Cas9一般設計：
CRISPR在敲除基因的時候，需要兩個成分：Cas9核酸酶和gRNA(guide RNA）。
Cas9和gRNA會形成一個Cas9核糖體蛋白，這個核糖體蛋白能結合到基因組上的靶序列上。 針對要敲除的某個基因，CRISPR文庫通常包含幾種gRNA，處理大量細胞，使每個細胞（平均）受到單個gRNA的影響。
用慢病毒蛋白對含有gRNA質粒進行包裝，轉染目標細胞，然后用嘌呤霉素進行篩選，轉染成功的細胞，DNA上會攜帶一個gRNA片段（說明該gRNA保留在了細胞中）；
對轉染成功的細胞進行培養，設置不同的時間點，提取細胞的DNA，對sgRNA進行PCR擴增，然后通過高通量測序，檢測sgRNA的read count；
實驗會設計多個timepoint來觀測sgRNA的read count的變化， 根據不同timepoint上sgRNA read count的不同，分析基因敲除后，對于該細胞生長、增殖的影響。
對Cas9表達的小鼠靜脈注射細胞以播種腫瘤；4 周后，收集肺組織進行腫瘤分析[Fig.3b]。通過MICSSS 對組織進行切片和染色以用于Pro-Code。對于每個樣本，用H&E或Pro-Code表位標簽特異性抗體對連續切片進行染色[Fig.3cd]。 然后對圖像進行分割和去條形碼，以識別每個腫瘤病灶表達的Pro-Codes(Fig.3e)。
使用基于密度的噪聲應用空間聚類(DBSCAN)算法將Pro-Code群體亞聚類為離散病灶，并使用alpha形狀推斷腫瘤邊界，然后進行手動管理(Fig.3e)。
為了確定體內是否有任何靶向基因影響腫瘤發育，作者比較了攜帶特定 nPC/CRISPR 的腫瘤比例與預注射細胞混合物中相同 nPC/CRISPR 的相對頻率[Fig.3f]。
兩個最耗竭的基因靶點是免疫檢查點Cd274(Pd-l1)和Cd47；相反，B2m靶向病灶顯著富集。同時作者觀察到一個CRISPR靶向干擾素信號IFNγ的正調節因子去富集現象，以及CRISPR靶向Socs1的富集，Socs1是IFNγ信號的負調節因子。值得注意的是，Tgfbr2靶向病灶在體內最豐富，表明KP細胞上TGFb 受體的缺失增強了腫瘤生長[Fig.3g]。
除了能夠測量與基因敲除相關的腫瘤病灶的數量和面積外，Perturb-map還可以評估不同基因如何影響腫瘤結構。為此，病理學家根據一系列臨床準則對每個病灶進行評分，這些標準包括癌細胞的分化程度、病灶的位置和基質的組成。根據包括壞死、纖維化和分化在內的特征組合確定不同的腫瘤組織學類型。使用卡方檢驗以確定基因擾動與病灶組織學特征之間的顯著關聯[Fig.3h,3i]。這些研究表明，Tgfbr2 和Socs1 的缺失以截然不同的方式改變了 KP 肺腫瘤的結構，但每一種都賦予了腫瘤生長優勢。
4.Perturb-Map識別調節TME免疫組成的基因
使用Perturb-map來研究腫瘤內和腫瘤周圍，不同的基因擾動是如何影響免疫細胞的募集和維持。
除了量化免疫浸潤外，作者還評估了每個腫瘤病灶內免疫細胞的空間分布[Fig.4f]。 然而在特定的基因的敲除病灶中存在顯著差異[Fig.4i,4k]。
由于Socs1敲除導致KP細胞上更高的PD-L1，作者假設局部T細胞功能障礙可能與觀察到的 Socs1敲除腫瘤的富集相一致。 為了測試這一點，分別給小鼠注射1:1混合的KP-Cas9-F8-gRNA和KP-Cas9-Socs1-gRNA細胞，并用抗PD-L1或同種型對照抗體處理。
轉移性病變可以演變出不同的分子狀態，甚至在單個腫瘤塊內，遺傳亞克隆也可以形成具有不同TME組成的空間不同區域； 然而，相鄰的遺傳異質區域如何相互影響尚未得到很好的探索。 作者試圖使用Perturb-map來研究相鄰腫瘤是否影響彼此的免疫浸潤。
這些結果表明，至少在SOCS1和TGFb通路改變的情況下，在彼此緊密接觸的肺腫瘤病灶中，免疫細胞的組成和空間排列非常局部地形成。 盡管這可能取決于特定的分子改變，因為某些基因表達變化可能會產生更遠的影響，但Perturb-map可以提供一種縮放方法來評估特定的基因改變如何影響局部、近端和遠端TME狀態。
5.Perturb-Map空間轉錄組識別擾動相關的分子特征
為了進一步確定不同基因擾動對腫瘤狀態的影響，作者將空間轉錄組與Perturb-Map結合。
1. 首先，對于4個接種nPC/CRISPR的小鼠肺的切片，使用10X技術測序。通過K-means聚類方法將樣本聚類，然后識別不同類的差異表達基因，區分腫瘤病變相對應的空間區域的特異的基因特征[Fig.5a]。結果發現，與周圍健康的肺組織相比，腫瘤病變區域高度表達特定的角蛋白和上皮標志物；以及在KP病灶中發現IFNg特征。
2. 在腫瘤群體中清晰且特異性地捕獲了Pro-Code轉錄本[Fig.5b]。由Pro-Code轉錄本定義的對腫瘤位點的基于圖形聚類，揭示了肺切片中不同且重復的腫瘤基因表達特征[Fig.5c]。和KP腫瘤的克隆發展一致，給定病灶相對應的空間位置通常聚集在一起，但也有與其他病變明顯聚集在一起的特定病灶。
3. 為了識別每個病灶中的基因擾動，作者通過成像質量流式細胞術對使用金屬結合抗體染色的肺組織切片進行成像?；诮M織內nPC/CRISPR的鑒定使用相應的基因擾動注釋每個基因特征，并揭示與其他KP腫瘤相比，攜帶CRISPR靶向Tgfbr2或Ifngr2的腫瘤呈現出不同的基因特征[Fig.5d]。
4. 在敲除Tgfbr2腫瘤中，許多相同的ISG也被下調，可能是由于腫瘤的T細胞排除狀態，并且各種膠原蛋白編碼基因增加。然而，很多上調的基因表明，TGFβ信號增加[Fig.5d,5e]。
5. Tgfbr2腫瘤中，TGFb誘導的基因促使我們測試KP/Tgfbr2 CRISPR細胞對TGFβ的反應性。證實它們沒有響應TGFβ激活TGFβ信號傳導，并且TGFBR2在這些細胞中確實被功能性敲除。
6. 因此，我們試圖了解TME中哪些細胞類型，Tgfbr2敲除可能對 TGFβ有反應。 使用CytoSig數據庫。在相關治療和細胞類型對之間創建代表性基因集，然后進行GSEA識別不同腫瘤簇中的這些特定細胞因子特征[Fig.5g,5f]。
這些發現表明，KP肺癌細胞上Tgfbr2缺失的結果是腫瘤中TGFb表達增加以及TME中TGFb通路激活。 這表明在Tgfbr2敲除病灶中觀察到的基質重塑和免疫排斥的潛在機制是癌癥相關成纖維細胞的TGFβ激活。
6. 驗證Tgfbr2的缺失導致更具侵襲性和T細胞排除的KP肺腫瘤
作者試圖確認與敲除Tgfbr2腫瘤相關的Perturb-map表型。為此，作者用靶向 F8(對照)或Tgfbr2的慢病毒編碼gRNA轉導KP-Cas9細胞并通過靜脈注射細胞進入小鼠。分別在注射后 7、14 和 28 天采集肺并檢查腫瘤負荷。
1. 在注射后7天內就可以發現，與對照相比， 敲除Tgfbr2的腫瘤更大、更豐富。該現象在后來更加明顯。
2. 與Perturb-map 中觀察到的相似，許多Tgfbr2腫瘤具有纖維粘液基質[Fig.6b]。通過阿新藍染色嚴重了這一現象[Fig.6c]。
3. 此外，正如在Perturb-map篩選中觀察到的，Tgfbr2 腫瘤內的 CD4+ 和 CD8+ T 細胞浸潤顯著減少[Fig.6d,6e]。 這證實了Tgfbr2的缺失重塑了KrasG12D p53null的肺腫瘤的TME。
五、結論
該研究建立了一種功能基因組學方法，能夠通過多重成像和空間轉錄組學在組織內解決pooled CRISPR篩選。Perturb-map的一個關鍵進步是，它拓寬了可以在功能基因組篩選中研究的基因類型和基因功能。大多數基于測序的pooled篩選方法需要分離細胞或組織，這會導致有關擾動如何影響細胞局部環境的信息丟失。通過對組織中的Pro-Codes 進行成像，使我們能夠評估不同的基因擾動如何不僅改變了腫瘤的播種和生長適應性，而且還改變了腫瘤形態和免疫細胞募集。
除了研究特定基因功能之外，Perturb-map還使我們能夠檢查特定基因擾動和相關表型如何影響鄰近的腫瘤區域。這是腫瘤生物學中一個相對未被充分探索的領域，但隨著越來越多的高分辨率研究報告了TME的異質性以及與腫瘤遺傳學的關聯，Perturb-map可以為因果研究提供一種有價值的手段，以確定特定基因如何影響腫瘤的局部和遠端區域。
Ref：Wroblewska A, Dhainaut M, Ben-Zvi B, Rose SA, Park ES, Amir ED, Bektesevic A, Baccarini A, Merad M, Rahman AH, Brown BD. Protein Barcodes Enable High-Dimensional Single-Cell CRISPR Screens. Cell. 2018
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