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今天給大家分享一篇2022年9月26日發表在Nature Communications（IF: 17.694）上，基于RAS致癌通路預測肺腺癌對化療的治療反應以及預后的文章。
RAS oncogenic activity predicts response to chemotherapy and outcome in lung
adenocarcinoma
RAS致癌通路預測肺腺癌對化療的治療反應以及預后
一．研究背景
RAS癌基因在將近20%的人類癌癥中發生突變，是腫瘤發生和發展的驅動因素。點突變主要發生在三種亞型HRAS、KRAS和NRAS的密碼子12、13和61中，并且點突變的發生會降低其編碼蛋白的GTPase活性，導致GTP結合的活性構象的積累。其中，KRAS是最常突變的RAS亞型，在胰腺導管腺癌（88%）、大腸腺癌（50%）和肺腺癌（32%）中的發病率特別高。大量文獻報道KRAS的突變在腫瘤侵襲性、轉移和化療抵抗中起到重要作用。
在此，本研究提出了一種基于RAS調節轉錄活性的樣本分子分型方法，該方法可預測肺腺癌和其他實體腫瘤的化療治療療效以及預后反應。作者推導出一個基因表達相關的特征稱為RAS84，并應用機器學習算法構建分類器，根據患者腫瘤中RAS84的表達對患者進行亞型分類。使用這種方法，作者發現RAS轉錄活性可以預測肺腺癌和其他幾種實體腫瘤的臨床預后，但實際上，KRAS突變本身并不能很好地預測這些癌癥的臨床預后。當將RAS84應用于化療治療患者隊列時，該研究的分類器預測RAS84表達水平最高的受試者治療療效較差。該方法將為研究大隊列患者中致癌RAS活性的影響提供可能性，并有助于預測與致癌RAS活性相關的治療敏感性，例如化療等。
二．研究結果
1、利用肺癌細胞系基因表達數據構建RAS84
作者旨在測量腫瘤細胞中RAS通路的活性。因此，作者將已建立的特征映射到CCLE數據庫中的肺癌細胞系數據，以確定哪些特征能夠準確測量并排除樣本中的基質細胞和免疫細胞致癌RAS活性。首先，作者通過去除細胞系中低表達或表達差異較小的基因來清除特征。為了進行準確分析，作者去除了KRAS以外（BRAF、EGFR、ERBB2、FGFR1、FGFR2、FGFR 3、HRAS、JAK2、KIT、NRAS和RET）具有致癌RAS通路突變的細胞系，因為這些突變可能也會驅動RAS信號傳導并混淆分析。對于每個特征，將過濾后的CCLE肺癌細胞系特征表達矩陣分為三組。作者根據組內特征基因的平均表達將簇命名為RAS-high和RAS-low以及Unclassified。隨后，作者使用KRAS突變在RAS-high和RAS-low組中的分布來評估RAS84捕獲RAS致癌活性的能力（圖1a）。為了強調檢測RAS致癌活性特征的特異性，作者還評估了RAS addiction signature和其他幾種致癌信號通路特征。RAS addiction signature來自依賴RAS信號維持細胞存活的KRAS突變細胞系。因此，這一特征更能代表RAS依賴性，而不是RAS致癌活性。作者確定“RAS pathway”、“KRASG13D134”和“HRAS”是RAS-high組中KRAS突變體富集的最佳體現（圖1a）。隨后，作者通過選擇驅動RAS-high和RAS-low聚類的基因來完善這三個特征。作者對這些組進行了差異基因分析，以確定RAS-high組中上調的特征基因。從這些基因中，作者構建了meta-RAS活性特征RAS84，并將其與CCLE肺癌細胞系數據進行了對比測試（圖1b）。RAS84成功地將42株KRAS突變株系中的36株放入RAS-high組，6株放入Unclassified組（圖1c）。作者還觀察到“RAS pathway”和RAS84分類之間的樣本標記有很好的重疊，并且與其他特征相比有一些差異。然而，與其他RAS和致癌特征相比，RAS84從RAS-low組中分離出的KRAS突變細胞系在統計學上最顯著可靠（圖1d）。最后，作者進行了差異分析，以確定RAS-high組的轉錄組變化，并發現RAS-high組在ERK1/ERK2/MAPK級聯通路中富集。
2. RAS84表達預測體外藥物敏感性和耐藥性
接下來，為了確定RAS84表達是否與抗癌藥物反應相關，作者分析了從GDSC和CTRP數據庫下載的藥物敏感性數據，研究對象為RAS-high和RAS-low CCLE細胞系。作者確定了在這兩組中這些藥物具有不同的藥物反應（圖2a）。
作者在表現出不同反應的藥物中測試了富集的藥物靶項（圖2b）。并發現RAS-high細胞系對靶向ERK MAPK和EGFR信號的藥物敏感，也對蛋白質穩定性和降解藥物敏感，如HSP90抑制劑。相反，作者發現RAS-high細胞系對靶向DNA復制、有絲分裂和染色質組蛋白乙酰化的藥物具有耐藥性。DNA復制和有絲分裂是常見的化療靶點，表明RAS84活性與體外化療耐藥相關。
隨后，作者還測試了KRAS突變（圖2c）和RAS通路突變依賴性藥物反應（圖2d）。并發現這兩個突變組僅對三種靶向ERK/MAPK信號的藥物敏感。在這些比較中，沒有觀察到對任何藥物的耐藥性。這一結果表明，RAS84比單獨存在KRAS突變或更廣泛的RAS通路突變體更好地捕捉RAS驅動的藥物反應，突顯了RAS84轉錄特征方法的重要性。
3. 肺腺癌中RAS84表達與KRAS突變相關
為了進一步驗證RAS84不僅僅局限于細胞系層面，作者將其應用于TCGA LUAD表達數據。考慮到與細胞系數據相比，患者腫瘤樣本中觀察到的特征表達的異質性增加，因此將樣本分為五組（圖3a），發現RAS84表達最低組中具有很少的KRAS突變（6%）. 其他分組中均具有較高水平的KRAS突變，介于25%和45%之間（圖3b）。隨后，作者使用上述各種特征對患者進行重新分組，發現RAS84在各組中對KRAS突變腫瘤進行了最佳分離（圖3c）。作者通過RAS84基因特征的平均表達水平，從低到高分別標記為RAG-0、RAG-1、RAG-2、RAG-3和RAG-4。為了確保RAS84表達主要是由腫瘤驅動的，作者觀察了五個NSCLC樣本的基質中RAS84的表達，并發現基質中表達量最小。隨后，給每個患者分配了一個RAS84-Index（RI）值，定義為RAS84的平均表達基因。為了進一步描述這些群體的特征，測試了是否有任何其他報道的基因組改變在五個亞型中表現出非隨機分布。作者確定了富集于一個或多個RAG組中的八個常見突變（圖3d），并使用這些亞型相關突變來表征五個RAG組的特征（圖3a）。KRAS極少突變是RAG-0的特征，但有趣的是，該組包含大量腫瘤抑制突變體（KEAP1、RB1和TP53）以及CTNNB1突變體，這也可以解釋腫瘤是如何發生的。由于p53的高水平改變（約70%），將其稱為P腫瘤。RAG-2和RAG-3中，除了頻繁的KRAS突變外，也具有許多EGFR突變，表明驅動這些簇的基因通過上游受體酪氨酸激酶（RTK）激活誘導RAS通路激活。然而，除了高KRAS突變率和高RAS84表達外，RAG-1以STK11/LKB1突變為主要特征（KL腫瘤），RAG-4的特征是CDKN2A突變（KC腫瘤）。TP53在幾個簇中經常改變，RAG-3在RAG-0之后p53突變率最高（KP腫瘤）。而RAG-2與其他RAS活性簇相比，p53（TP53）改變水平適中（約40%），CTNNB1突變更多，但仍僅約5%，稱之為K腫瘤。
隨后在87名患者的獨立肺腺癌隊列（GSE40419）中驗證了RAG中KRAS、EGFR和TP53突變的模式（圖3e）。但考慮到該隊列較小，不可能以穩健的方式將所有特征的患者進行聚類，并沒有觀察到特定的KRAS氨基酸突變與RAG組之間的顯著關聯，這可能暗示在肺腺癌的情況下，特定的突變不會以不同的方式驅動RAS活性異質性（圖3b）。
為了確定RAS84表達是否反映RAS-MAPK信號活性，作者觀察了每個RAG內ERK1/2（T202，Y204）和MEK1（S217，S221）的磷酸化水平。對349名TCGA-LUAD患者的TCPA RPPA數據分析發現在所有的RAG中，相較于RAG-0其他RAG ERK1/2和MEK1的磷酸化水平都有所增加（圖3f）。作者還研究了哪些RAS84基因主要驅動RAG活性。作者重點研究了各個簇間變異最大的基因，并通過相關性分析，發現了七個能夠區分五個RAG的小基因簇（圖3g）。
4. RAS84表達主要是克隆性的
為了評估肺腺癌中RAS活性的腫瘤內異質性，作者將來自多區域TRACERx隊列的樣本（41例患者）分為五個RAS活性組，使用TCGA-LUAD分類結果訓練支持向量機（SVM）分類器，并把TRACERx樣本按照RAG標簽歸類（圖4a）。
在41例患者中，28例（68%）有多區域RNA序列基因表達數據可用。在這28名患者中，16名（57%）患者的所有區域均位于同一RAG內（圖4a）。12名（43%）患者的區域跨越RAG，表明某些患者存在一定程度的RAS活性異質性。在這12名患者中，有9名患者的腫瘤區域的RAG是相鄰的（RAG-4/3:4；RAG-3/2:1；RAG-2/1:1；RAG-1/0:3）。其余三名患者（CRUK0017、CRUK0024和CRUK0060）跨越兩個以上相鄰的RAG，表明整個腫瘤的RAS活性存在一定程度的相關性和異質性。CRUK0017跨越三個簇，RAG-3/2/0。據TRACERx報告，該患者為KRAS突變的亞克隆（PhyloCCF R1:0；R2:0.84；R4:0.65）。有趣的是，KRAS非突變區域屬于RAG-0。患者CRUK0024和CRUK0060都有兩個非相鄰的簇，即RAG-3/1。此外，作者還觀察到，與腫瘤間距離分布相比，這些跨越腫瘤的組內RAS84的腫瘤內距離仍然很小（圖4b）。
隨后，作者在TRACERx肺腺癌隊列中發現，RAS84基因在腫瘤內表達差異小和腫瘤間表達差異大組中富集（圖4c）。說明RAS84在遇到樣本偏差時仍具有較強的魯棒性。
5. RAS84預測肺腺癌患者的生存率和化療反應
突變的KRAS癌基因在許多臨床前模型中促進腫瘤進展和轉移，但KRAS的突變狀態與患者生存率并沒有顯著的相關性（圖5a）。為了確定RAS84在肺腺癌中是否具有預后價值，作者進行了單因素Cox比例風險分析，發現與RAG-0相比，RAG-4與不良預后相關（圖5b，c）。隨后，作者還將RAS84 RAS-Index（RI）值進行單因素Cox比例風險分析，并發現與預后顯著正相關，表明RAS84表達增加是總體生存率差的預測因子（圖5d）。隨后，作者還對RAG進行多因素Cox比例風險分析，模型中除了RI值包括TNM分期、性別和年齡等，并且發現RAG是預后的重要預測因子，特別是RAG-4、RAG-3和RI與不良預后顯著相關（圖5e-h）。
此外，與已經發表的特征比較發現在校正其他預后預測因子的多變量分析中，只有RAS84顯著預測預后（圖5i）。這表明RAS84在早期肺腺癌中具有超出已知臨床預測因子的預后質量，并進一步表明RAS通路活性促進了人肺腺癌的腫瘤進展。
鑒于在體外觀察到化療耐藥表型，作者使用TEMPUS腺癌患者隊列進行了PFS多因素Cox比例風險分析。作者選擇接受一線化療的患者，并使用相關的RNA-seq數據和SVM分類器對患者腫瘤進行分類。發現RAG是化療后PFS的顯著預測因子。簡而言之，與RAG-2相比，RAG-3和RAG-4患者的PFS較差（圖5j）。最后，與其他已發表的RAS特征對進行對比也發現RAG-3以及RAG-4具有比較高的風險（圖5k）。
6. RAS84預測不同癌癥類型的RAS-MAPK通路活性
RAS活性在腫瘤發生和癌癥進展中的重要程度因不同組織而異，已知一些癌癥主要由RAS突變驅動（例如胰腺癌、結直腸癌和肺癌），而其他癌癥則不是（例如葡萄膜黑色素瘤、膠質母細胞瘤、腎癌）。為了確定RAS84如何確定RAS活性在不同癌癥類型中的差異，作者在泛癌分析中對所有32種TCGA實體腫瘤進行了量化。為了比較不同癌癥的樣本，計算了每個樣本的RI值（圖6a）。根據每個癌癥的平均RI值分布確定了兩個不同的癌癥人群（圖6b）。在RAS高度活躍組中，發現已知RAS驅動的前五種RAS突變癌癥中的四種（胰腺癌（PAAD）71%，結腸腺癌（COAD）50%，直腸腺癌（READ）49%和肺腺癌（LUAD）31%）。作者還發現KRAS突變主要富集在該組中。在高RI組中發現的其他癌癥包括胃腺癌（STAD）（8.9%）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）（8.3%）、頭頸部鱗癌（HNSC）（5.8%）、宮頸鱗癌和宮頸腺癌（5.2%）、肺鱗癌（3.5%）和食管癌（1.2%）。為了解釋高RAS活性組中存在這些癌癥，作者研究了RAS通路改變狀態與隊列中平均RI之間的相關性（圖6c）。胃癌（STAD）、膀胱癌（BLCA）、頭頸部鱗狀細胞癌（HNSC）、食管癌（ESCA）和肺鱗狀細胞瘤（LUSC）的RAS通路改變率均高于50%，均在99%的置信區間內，表明RAS以外的RAS途徑改變是這些癌癥的驅動因素。
皮膚黑色素瘤（SKCM）和甲狀腺癌（THCA）的平均RIs低于其RAS通路改變率的預測值（圖6c）。有趣的是，NRAS是這兩種癌癥中RAS的主要突變亞型。然而，RAS突變與SKCM中的RI不相關，卻在THCA中顯示出顯著的負相關（圖6d），表明突變的RAS不是這些癌癥中RAS通路活性的主要驅動因素。有趣的是，THCA和SKCM的BRAF突變比例最高（57%和50%），其次是結腸（10%）。并且發現BRAF突變與高RI值顯著相關（圖6e）表明BRAF是這兩種癌癥中致癌RAS通路活性的關鍵驅動因素。
為了進一步驗證RAS84表達可以預測單個癌癥中RAS突變體的高RAS活性，觀察了每個隊列RI值與RAS突變（KRAS、NRAS、HRAS）的關系，并發現PAAD、LUAD、HNSC、THYM、BRCA、UCS等中RAS突變與RI之間存在顯著正相關（圖6d），進一步強化了RAS84可以預測這些癌癥中RAS活性的觀點。對于THCA和TGCT這兩種癌癥，觀察到RAS突變與RI呈負相關。如前所述，THCA具有較高的BRAF突變水平，有一些NRAS突變，但很少有KRAS突變。TGCT的特點是KRAS（8%）和NRAS（3%）突變水平低。RAS野生型組中較高的RI活性表明，這些樣本中可能存在RAS信號的強烈激活物，例如自分泌生長因子的產生，或突變數據中不明顯的突變體中的負反饋環。
為了確定RAS84在除LUAD以外的其他癌癥中是否具有預后作用，作者對RAS高度活躍癌癥組中的隊列進行了總體生存率與RI值的Cox比例風險回歸分析，并且確定了PAAD與CESC中RAS84表達與預后的顯著相關性（圖6f，g）。
三、總結
這篇文章開發了一種新的基因特征RAS84，可以很好地用于捕獲肺腺癌中的RAS通路致癌活性。使用RAS84特征不僅可以很好地將肺腺癌患者進行分層還可以預測患者的預后以及化療反應。相較于其他特征構建文章，該研究首先以體外細胞系特征構建為切入點，后結合不同中心的肺腺癌研究隊列進行特征驗證，區分腫瘤亞型，進行細致的解析刻畫，是有助于臨床決策的。因此，小編認為這種分析方式和角度是很值得嘗試的！！！
