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Systematic discovery of mutation-directed neo-protein-protein interactions in cancer
系統性地發現與驗證癌癥中突變導致的新蛋白質-蛋白質相互作用
一．研究背景
基因組突變數據可提供潛在的癌癥驅動基因和治療靶點。然而，即使在同一癌癥基因中，不同的驅動突變也可能在功能上不同，具有不同的臨床意義。因此，將這種癌癥突變信息轉化到突變氨基酸水平，對于識別突變等位基因特異性靶點、生物標記物等來說至關重要。在編碼可作用靶點的驅動基因中發現了一些突變，但大多數突變位于與已知藥物無直接聯系的基因中，或位于編碼“不可抗”的基因中，如銜接蛋白或腫瘤抑制因子。這些蛋白質主要通過蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡與其他細胞成分的相互作用發揮其功能。因此，了解癌癥驅動突變如何通過改變的PPI整合到細胞信號網絡中，可能會導致潛在的通路干擾策略治療癌癥（圖1A）。錯義突變是導致腫瘤發生的常見基因組變異。突變（MUT）等位基因可能在編碼的蛋白質上產生新的表位（圖1A）。這種突變可能改變編碼蛋白質的內在特性。這些新表位也可能產生對接位點以誘導新相互作用，或阻礙削弱現有的相互作用。這種新表位觸發的差異性PPI（Df-PPI）可能指示重新連接的致癌程序，這些程序是腫瘤細胞生長和擴散失調的基礎，并可能揭示治療干預急需的腫瘤特異性分子靶點。然而，由癌基因和抑癌基因突變引發的新相互作用的范圍仍有待確定。
二．研究方法
在這里，該研究建立了一個基于NanoLuc熒光素酶的生物發光共振能量轉移（BRETn）差異PPI識別平臺，該平臺可比較篩選野生型（WT）和突變體（MUT）等位基因對應物，以檢測活哺乳動物細胞中與癌癥相關蛋白的差異相互作用（圖1B）。該技術為定量高通量差異篩選（qHT-dS），能夠從17792對潛在PPI的檢查中系統地鑒定32個等位基因的差異WT和MUT相互作用蛋白。對Df-PPI數據集的分析顯示，癌基因和腫瘤抑制基因的錯義突變引起的相互作用廣泛增加。對突變導向的新形態PPI（neo-PPI）的檢測揭示了癌基因和抑癌基因突變形式的潛在替代機制和信號通路。選擇BRAFV600E /KEAP1相互作用進行驗證，使用一組正交分析將其提升至經驗證的neo-PPI狀態。該neo-PPI重定向BRAFV600E上調NRF2介導的氧化還原信號。qHT-dS平臺能夠在單個突變殘基分辨率下加速發現Df-PPIs，所得數據集可作為生物醫學界精確腫瘤學方法的資源。
三．研究結果
1、腫瘤相關基因表達文庫用于PPI篩查
為了確定由基因組改變編碼的復發突變殘基產生的新蛋白，該研究試圖建立突變殘基和具有明確的癌癥相關蛋白的連接，用于重點對比檢查。為此，構建了一個癌癥相關基因表達文庫，為OncoPPi v2文庫（圖1C），由556個不同的人類WT蛋白編碼ORF組成，以搜索驅動突變的相互作用伴侶。為了選擇人類癌癥突變等位基因以發現Df-PPI，建立了一組致癌突變表達載體，為OncoMut文庫。對于驅動突變的比較研究，首先關注兩個定義明確的癌基因和四個頻繁突變的腫瘤抑制基因中的復發性突變，這些基因具有來自不同腫瘤譜系的24個等位基因（圖1D）。OncoMut文庫包含癌基因AKT1和BRAF的突變；腫瘤抑制因子SPOP、F-box和FBXW7和轉錄調節因子SMAD4和SMARCA4。
2. qHT-dS平臺用于比較分析WT和MUT PPI
為了識別活細胞中的Df-PPIs，建立了一個差異篩選平臺qHT-dS（圖1B）。通過使用1536孔板格式的基于BRETn的超高通量PPI篩選技術實現。為了確保對qHT-dS數據進行嚴格的統計評估，開發了對相互作用進行比較分析的（CARINA）算法，以量化相互作用信號的強度（圖2A）。將fold-over-control（FOC）數據與BRET飽和曲線的曲線下面積（AUC）值（PFOC）的p值分析相結合，進行對比研究，以確定WT和MUT的PPI（圖2B-2D）。通過CARINA分析，共為每個PPI及其相應的對照組建立了55600條BRET飽和曲線。與單點蛋白質表達二元PPI映射不同，qHT-dS包含蛋白質表達的變化。當FOC≥1.2，PFOC≤0.01時，CARINA識別出50%以上的已知WT PPI，而低于1.2的FOC下限僅會略微增加篩查中檢測到的已知PPI數量（圖2C）。因此，FOC ≥1.2和PFOC≤0.01被用作定義統計顯著性PPI的主要閾值。利用這些參數，共識別出8839個PPI（圖2D）。這些PPI可作為進一步評估的候選相互作用，以確定不同的PPI。
3.確定不同PPI的優先級
為了鑒定突變驅動的Df-PPI，根據WT和MUT-PPI圖譜的FOC值進行了比較分析。為了區分相互作用的獲得（Go-PPI）和相互作用的喪失（Lo-PPI），計算WT和MUT-PPI曲線之間的差異以獲得差異分數（DS）以及相應的p值（PDS）（圖3A）。根據DS和PDS，確定了864個差異Go-PPI（DS>1，PDS<0.001）和172個差異Lo-PPI（DS<1，PDS<0.001）。應用QDS<0.01和DS ≥1.5或DS≤1.5為高嚴格（HS）閾值，表明WT和MUT PPI信號之間至少有50%的差異，HS-Go-PPI和HS-Lo-PPI組分別有359和13 個PPI（圖3A和3B）。這372個高嚴格差異PPI用于評估等位基因依賴性相互作用的特異性和性質。通過對HS-Go-PPI圖譜的分析，不同的基因產物，甚至同一基因的不同等位基因，在相互作用伴侶中表現出顯著的差異（圖3C）。例如，在SPOP和FBXW7中，發現不到10%的重疊Go-PPI伴侶發生突變。G386D與D351H SMAD4等位基因和F102C與F133V SPOP等位基因的共享伴侶比例分別為13%和30%，表現出突變特異性相互作用。令人驚訝的是，同一位點的突變以殘基依賴的方式顯示出不同的相互作用。例如，62%的SPOP F133L伴侶與F133V伴侶不同。由于與熱休克蛋白90（HSP90）的一般伴侶功能相關，這種突變等位基因特異性相互作用不太可能發生，盡管許多疾病突變體顯示與HSP90的相互作用增加。事實上，僅識別到HS-Go-PPI和HSP90已知PPI伴侶之間的小部分重疊（1.4±0.9%）（圖3C）。這些結果凸顯了突變等位基因介導的Go-PPIs的特異性以及在蛋白質連接性水平上潛在的等位基因依賴性腫瘤異質性。為了深入了解等位基因驅動的致癌程序，對每個伴侶的等位基因選擇性進行了檢查（圖3D）。總的來說，35%的HS-Go-PPI伴侶與3個或更多的等位基因相互作用，通過不同的突變涉及共同的致癌通路。這些HS-Go-PPI伴侶在核心生長調節途徑中發揮作用（圖3E）。實驗結果也顯示，多種突變殘基參與了常見通路，如細胞周期、PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT通路，為致癌基因的表達提供了機制基礎功能的這些驅動突變（圖3F）。此外，大多數HS-Go-PPI伴侶（65%）與一個或兩個等位基因相互作用，表明這些伴侶和相應的通路可能在含有某些突變的癌癥中發生特異性改變（圖3D）。
4. neo-PPI候選相互作用的實驗驗證
為了收集進一步的實驗證據以驗證突變介導的差異PPIs，對HS-Df-PPI數據集進行了采樣，以便在哺乳動物細胞中進行同源性BRET和GST pulldown的實驗驗證。總的來說，325個PPIs中有265個顯示出差異結合信號，代表了82%的HS-Df PPIs（圖4）。對BRAFV600E介導的neo-PPIs候選相互作用（圖4A）在黑色素瘤、肺癌和結腸癌細胞中進行了檢測，其中BRAFV600E定義了一個患者亞群，并進行了三次補充性分析。（i）NanoPCA分析用于確認癌細胞中接近內源性表達水平的BRAFV600E neo-PPIs，表明在A375黑色素瘤細胞和H1299肺癌細胞中分別與BRAFV600E有44和38個結合的相互作用（圖4A和4C）。（ii）標記BRAFV600E的標記物用于檢查其與內源性結合伴侶的相互作用。在肺癌細胞的flag-BRAFV600E免疫復合物中檢測到15個內源性伴侶（圖4D）。在結腸癌細胞系中進行內源性flag-V600E co-IP研究進一步證實了五種neo-PPIs（圖4Ei）。（iii）利用co-IP質量抗體證明內源性BRAFV600E與VHL、BCL2L1和KEAP1在患者來源的含有BRAFV600E的癌細胞形成復合物（圖4Eii）。同樣，在MCF7乳腺癌細胞中檢測AKT1E17K neo-PPI，在HCT116結腸癌細胞中檢測SMAD4G386D PPI，并在C4-2前列腺癌細胞中評估SPOPF133L伴侶與內源性伴侶的相互作用（圖4F-4H）。
5. neo-PPI候選相互作用闡述腫瘤抑制基因和癌基因突變的假說
該研究檢查了已確定的腫瘤抑制蛋白和癌基因蛋白的PPI核心元素。通常認為，腫瘤抑制基因通過功能缺失突變導致腫瘤發生，從而損害其腫瘤抑制功能。出乎意料的是，Df-PPI數據顯示，腫瘤抑制基因突變同時表現出Lo-PPIs和Go-PPIs以及一組不同的癌癥相關蛋白，這意味著腫瘤抑制基因可能通過neo-PPI獲得新形態活性。例如，SMAD4G386D與GSK3β的相互作用增強可能使SMAD4G386D獲得影響GSK3β調節的Wnt/b-catenin途徑的能力。SPOPF133L是一種在前列腺癌中頻繁突變的腫瘤抑制因子，它不僅失去了與已知WT結合伴侶的相互作用，如BRD4和NCOA3（SRC-3），而且增強了與其他伴侶的相互作用，如c-JUN（圖4H）。SPOPF133L /c-JUN neo-PPI支持以下假設，即SPOP突變可能參與c-JUN通路以驅動AP-1介導的致癌程序。qHT-dS數據還表明，致癌激酶的驅動突變，如AKT1E17K和BRAFV600E，能夠與多個結合伴侶相互作用，這可能會重新連接致癌途徑，并提出替代途徑干擾方法（圖4）。例如，該研究的篩查揭示了AKT1E17K的51個等位基因選擇性結合伴侶（圖4F）。AKT1E17K介導的相互作用得到了其他數據集的支持，包括與乳腺癌細胞中內源性伴侶的結合、共同的亞細胞定位以及一部分伴侶的已定義AKT1磷酸化基序的存在（圖4F）。在已鑒定的Go-PPI中，E17K突變似乎增強了AKT1與DNA損傷反應（DDR）蛋白質的相互作用，如ATM和FANCC/E（圖4F），這增加了AKT1E17K可能改變細胞對DNA損傷和修復的反應的可能性。AKT1E17K狀態與增強的細胞對DNA損傷信號的抵抗力呈正相關，支持未來對AKT1E17K可能通過NOOPI和ATM調節DDR的假設的檢驗。類似地，熱點突變V600E使BRAF能夠與RAS /MEK信號級聯之外的蛋白質伴侶相互作用。與WT對應物相比，確認了BRAFV600E的NRAS和14-3-3β的常見PPI以及MEK1的Lo-PI（圖4A和4B）。、還確定了47個V600E增強的PPI候選相互作用，顯著擴展了BRAFV600E突變等位基因介導的致癌通路（圖4A-E）。
6. BRAFV600E與KEAP1的neo-PPI的驗證
基于以上研究，假設突變的BRAFV600E產生了一個新表位，與KEAP1的親和力增強，這可能通過調節NRF2介導的通路影響ROS反應。為了驗證這一假設，通過一組互補的生化和細胞實驗進一步評估了這一neo-PPI。與qHT-dS結果一致（圖5A），在GST pulldown實驗中，BRAFV600E顯示出明顯高于WT和其他BRAF突變體與KEAP1的相互作用信號（圖4）。通過Venus-PCA分析（圖5B），在顯示細胞質定位的活細胞中，以及在內源性細胞條件下，通過對一對等基因細胞系（圖5C）和一組患者來源的BRAFV600E黑色素瘤細胞系（圖4E）的co-IP研究，證明了這種neo-PPI，支持其在生理條件下的存在。研究表明BRAFV600E的激酶結構域和KEAP1的KELCH結構域導致了它們的關聯（圖5D）。通過BLI分析純化的蛋白質，BRAFV600E的激酶結構域（而非WT的激酶結構域）顯示出與KEAP1 KELCH結構域的直接結合BLI信號（圖5E）。用vemurafenib治療BRAFV600E攜帶細胞以劑量依賴性方式減弱BRAFV600E與KEAP1的相互作用（圖5F）。總之，這些數據有力地支持了BRAFV600E /KEAP1這一neo-PPI。
7. BRAFV600E /KEAP1 neo-PPI導向NRF2信號
事實上，BRAFV600E（而非WT）的過度表達顯著穩定了NRF2蛋白（圖6A和6B），增加了其轉錄ARE報告活性（圖6C），增加了NRF2及其靶基因NQO1的蛋白水平（圖6D），但沒有增加NRF2 mRNA水平（圖6E）。與WT細胞系相比，BRAFV600E黑色素瘤細胞系中的NRF2蛋白及其下游NQO1蛋白水平（圖6G和6H）顯著升高。這些數據得到CCLE數據集的支持，顯示上調的NQO1 mRNA水平與BRAF的V600E狀態呈正相關（圖6I）。此外，用vemurafenib治療BRAFV600E黑色素瘤細胞可降低KEAP1結合，導致NRF2和NQO1蛋白水平下調（圖5F和6J）。MEK1抑制劑對KEAP1/NRF2活性沒有影響（圖6K）。BRAFV600E表達增加與KEAP1復合物中NRF2數量減少相關，表明BRAFV600E取代了KEAP1復合物中的NRF2（圖6L）。這些結果表明了BRAFV600E誘導的KEAP1隔離模型，其中BRAFV600E通過與KEAP1的競爭結合激活NRF2，此外還有先前報道的轉錄調節機制。為支持該模型，KEAP1的沉默使NRF2蛋白水平對BRAFV600E狀態無反應（圖6F）。進一步分析了CRISPR-Cas9數據，發現BRAFV600E突變使癌細胞依賴KEAP1生存，對KEAP1敲除的敏感性增加（圖6M）。因此，BRAFV600E細胞可能遺傳對KEAP1控制通路的內在敏感性。
8. 化合物篩選證實了BRAF V600E突變所帶來的互作上的缺陷
為了尋找利用BRAFV600E相關脆弱性的潛在治療劑，利用一對帶有V600E突變或無突變的BRAF的基因工程MCF10A細胞系進行化學篩選。利用生物活性化合物文庫進行平行細胞活性篩選，發現一類醌類化合物對V600E細胞具有選擇性生長抑制作用（圖6N）。這一結果證實了路徑分析的觀察結果，該分析將BRAFV600E /KEAP1相互作用與NQO1的增強激活聯系起來。因此，V600E突變的獲得有可能導致NQO1功能的提高，從而提高對有毒NQO1底物的敏感性。為了驗證這一論點，利用脫氧喹啉酮（DNQ）（圖6O），一種有效且特異的NQO1底物，來檢測其對BRAFV600E細胞存活的影響。當用DNQ處理時，BRAFV600E攜帶細胞對DNQ的敏感性高于WT細胞（圖6P）。觀察到的差異反應曲線顯示，使用BRAFV600E的WM3482細胞系比使用BRAF WT和DNQ處理的CHL細胞系的敏感性顯著增強（圖6Q）。因此，黑色素瘤癌細胞中的BRAFV600E可能觸發對NRF2-NQO1調節的細胞毒性醌衍生物的敏感性增強。鑒于BRAFV600E /KEAP1 neo-PPI可由BRAFV600E抑制劑vemurafenib調節（圖5F和6J），確定vemurafenib是否能與DNQ協同抑制V600E癌細胞的生長。使用BRAFV600E突變的WM3482細胞系作為模型，與單獨使用DNQ治療相比，使用維莫拉非尼后再使用DNQ治療顯示DNQ的效力略有下降，表明vemurafenib對DNQ有負面影響（圖6R）。然而，當我們用DNQ預處理細胞，然后用vemurafenib逆轉治療順序時，觀察到DNQ的效力顯著增加（圖6R）。在BRAFV600E突變的多個黑色素瘤細胞系中也觀察到了這種有效的順序組合效應（圖6S）。因此，BRAFV600E與KEAP1的neo-PPI不僅重新連接了NRF2調節的氧化還原通路，而且還產生了對細胞毒性NQO1底物敏感性增強的細胞狀態。未發現的BRAFV600E變異體定向組合策略支持對已證實的neo-PPI的未來探索，以用于機制研究和neo-PPI治療策略（圖6T）。
四、總結
總之，該研究結果支持通過突變等位基因激活的PPI重組突變驅動的致癌途徑的概念。經實驗驗證的neo-PPI提供了產生可測試假設的基礎，以進一步檢驗其功能意義。這種突變決定的PPI不僅可以增強我們對癌癥分子重編程的理解，而且還可以揭示針對腫瘤變體介導的治療干預機制的潛在方法，這可能適用于癌基因和腫瘤抑制基因的基因組改變。從該研究的定量篩選平臺、生物信息學和實驗注釋以及驗證性研究中獲得的Df-PPI數據集和neo-PPI數據集，為科學界提供了一個有價值的資源，用于變異介導的分子相互作用研究，以加速精準醫學方法。
