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Hi, guys~ 好久不見呀！今天小編跟大家分享的是Molecular Cancer上的一篇單細胞文章，該雜志的IF已經41+了啊！！！讓我們看看，在單細胞文章數量呈井噴式增長的當下，該研究是怎么僅憑四個樣本以及簡單的分析沖出重圍的呢？話不多說，咱們看正文吧。
研究流程
本研究選擇的癌型是伴有破骨細胞樣巨細胞的胰腺未分化癌(UCOGCP)，這是胰腺導管腺癌（PDAC）的一種罕見亞型。作者收集了一名UCOGCP患者（pca_ai1）和三名PDAC患者（pca_0708, pca_0713,pca_0714）的手術標本，經過組織解離、細胞純化、文庫構建等，對18,376個細胞進行了單細胞測序，然后對得到的scRNA?seq數據進行預處理。接下來，就是常規的生信分析，包括細胞的聚類分析、可視化和注釋，軌跡擬時序分析，細胞通訊分析，功能富集，調控網絡分析，以及其他數據集和免疫組化的驗證（圖1.A）。
研究結果
1、細胞聚類和注釋
在0.6的分辨率下，作者識別出了19個具有不同基因表達模式的細胞簇（圖1.D-E）。同三個PDAC樣本相比，UCOGC樣本中內皮細胞，成纖維細胞和髓系細胞占比更高。考慮到破骨細胞樣巨細胞（OGCs）可能起源于間質上皮細胞，作者又分析了在cluster 13和cluster 15（I型導管細胞的兩個簇）中，間質上皮細胞的標志物EPCAM和KRT19以及OGC的標志物CD68的表達水平，發現cluster 15除表達KRT19外，還表達KRT81、PAEP 和 LINC01615，但不表達EPCAM（圖1.I）。對KRT81的免疫組化也證實了cluster 15含有OGC，表明 OGC 很可能起源于間充質上皮細胞而不是髓系細胞(圖1.J)。
2、UCOGCP 中I 型導管細胞的異質性
研究將I型導管細胞簇進一步分成了四個subclusters（圖2.A-B），同其他樣本相比，UCOGCP富集上皮亞型subcluster 2、3（圖2.C-E）。其中，subcluster 3表達有限的上皮標志基因EPCAM，但卻表達癌癥干細胞標記基因CD44和NOTCH2，并顯著富集“MYC-TARGET_V1”通路，以及“細胞外基質組織”、“創傷反應”、“多細胞生物發育”、“白細胞黏附”等GO通路（圖3.F-G，J）。基于TCGA-PAAD數據集的驗證表明，這些通路的特征基因的高表達多與較差的生存相關。
基于此，作者又把subcluster 3重聚類為五個亞型（圖3.A-B），cluster 4和cluster 1表達癌癥干細胞樣細胞（CSCLCs）的標記基因CD24, CD44和EPCAM，cluster 0和cluster 2 表達CD44 和 NOTCH2（圖3.C）。Cluster 0與上文中疑似OGC的cluster 15具有高度的重合（圖3.D），該亞型富集到了抗原呈遞、造血干細胞分化和G2/M負向調控等通路（圖3.E），軌跡分析和不同模塊的GO富集結果表明該簇可能是CSCLCs失調產生的多核細胞。
3、UCOGCP中導管細胞的軌跡分析
為了進一步分析UCOGCP中上皮細胞簇的發育過程，研究將前面提到的cluster 13和cluster 15重新分成9個clusters（圖4.A-B），并進行了軌跡分析。在得到的三個分支中，cluster 13和cluster 15屬于不同的分支（圖4.C-D）。不同狀態中高表達的基因富集的功能通路也存在差異（圖4.E），在決定細胞命運走向時，起關鍵作用的基因有APOE, MUC13, NEAT1, SERPINE1, SRGN和TIM1（圖4.F）。此外，根據轉錄組熱圖可以發現E2F1、MYC、EGR4等轉錄因子在缺乏EPCAM的上皮細胞簇，即分支1中高度表達（圖4.G）。
4、UCOGCP中TAM細胞的異質性
在最初的聚類中，研究發現UCOGCP中存在大量的腫瘤相關髓系(TAM)細胞。所以，作者將四個樣本中的TAM細胞又劃分為五個簇（圖5.A-C）。UCOGCP中的髓系細胞主要分布在cluster 2和cluster 3（圖5.D-E），在驗證集中，這兩個簇的特征基因與OS相關（圖5.G）。通路富集分析的結果也表明了這些簇在代謝途徑上的不同（圖5.F）。
5、腫瘤相關成纖維細胞和內皮細胞的異質性
接下來，作者分析了所有樣本中的成纖維細胞，共得到四個簇，都高表達成纖維細胞的標志基因ACAT2（圖6.A-D）。其中cluster 3來自UCOGCP樣本，與白細胞粘和MHCII 抗原呈遞相關（圖6.H）。
然后，作者又將腫瘤相關內皮細胞分為六個簇，它們高表達標志基因PECAM1（圖7.A-C）。其中，86%的內皮細胞來自UCOGCP樣本（主要分布在cluster 3和cluster 5），與UCOGCP是容易出血的腫瘤這一事實一致（圖7.D-E）。GSVA 分析表明每個簇富集到了不同的KEGG通路（圖7.F）。
6、細胞通訊
基于之前的細胞聚類和功能注釋，作者將UCOGCP中的細胞分成了22個簇（圖8.A-B）。通過分析破骨細胞標志基因的表達水平，研究發現OGCs可能只是在形態上類似于破骨細胞，并不表達CD68（圖8.C）。細胞通訊分析的結果揭示了OGC和PSC、巨噬細胞_I/III、某些上皮細胞和內皮細胞之間的強受體-配體相互作用（圖8.D）。其中，SPP1-CD44、CD74-MIF、CD74-COPD和CD74-APP等受體-配體對表現出強相互作用（圖8.E-F），這些特征基因的表達水平與預后顯著相關。
整個研究內容大體就是這樣，雖然是很經典的單細胞分析流程，圖片也沒有很驚艷，但文章勝在選題，小編發現PUBMED中UCOGCP相關的文章寥寥無幾，單細胞相關的就更是相當于沒有了，加上作者重點突出、層層遞進，該有的都有，故事講的算是完整，而且人家用的是自測數據，再來那么一丟丟運氣，這不就直接沖到40多分了！加油呀，各位打工人！Have a nice day~~~
參考文獻：
Wang, X., Miao, J., Wang, S. et al. Single-cell RNA-seq reveals the genesis and heterogeneity of tumor microenvironment in pancreatic undifferentiated carcinoma with osteoclast-like giant-cells. Mol Cancer 21, 133 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01596-8
