掃碼聯(lián)系客服
大家好！今天給大家介紹一篇發(fā)表在Genomics, Proteomics & Bioinformatics (IF:6.409)上的鑒定人視網(wǎng)膜色素上皮中與衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)和功能改變的（Identification of age-associated proteins and functional alterations in human retinal pigment epithelium）文章。視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）具有滋養(yǎng)和支持神經(jīng)視網(wǎng)膜等功能，對(duì)老年性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。然而，REF在衰老過(guò)程中分子變化仍然不是十分清楚。在本篇文章中，作者對(duì)10到67歲的18例樣本中分離人類原發(fā)性RPE（hRPE）細(xì)胞并進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明RNF123和RNF149相關(guān)的泛素化在保護(hù)hRPE細(xì)胞免受衰老過(guò)程中氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。此外，在衰老的hRPE細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)和分泌蛋白中凋亡信號(hào)通路上調(diào)而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組織下調(diào)。下面，就讓我們看看這篇文章的具體分析內(nèi)容吧~
流程圖：
結(jié)果：
1.本研究整體流程
首先，作者根據(jù)眼睛捐贈(zèng)者的年齡將樣本分為三組，分別為青年組4例（Y，10-18歲），中年組7例（M，35-41歲）和老年組7例（O，55-67歲）。分離hRPE細(xì)胞并培養(yǎng)兩代。為了鑒定不同分組下hRPE細(xì)胞系之間細(xì)胞內(nèi)和分泌蛋白質(zhì)組的變化模式，作者使用TMT-10plex進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)。在hRPE細(xì)胞的第三代傳代時(shí)，提取和消化細(xì)胞內(nèi)和分泌蛋白并使用TMT標(biāo)記。對(duì)樣本使用TMT-10plex隨機(jī)標(biāo)記來(lái)消除批次效應(yīng)并進(jìn)行LC-MS。
2.hRPE細(xì)胞的蛋白質(zhì)組特征
在7921個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白中鑒定到74502條肽段，平均覆蓋度為25.1%。在3843個(gè)分泌蛋白中鑒定到27930條肽段，平均覆蓋度為17.4%（圖1A）。其中有5735個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白和2455個(gè)分泌蛋白在所有樣本中進(jìn)行定量。質(zhì)控結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)蛋白的變異系數(shù)（CV）不超過(guò)2.55%而分泌蛋白的CV不超過(guò)3.22%，豐富度前10的細(xì)胞內(nèi)蛋白分別為PLEC,AHNAK,MUH9,FLNA,VIM,FLNC,PRKDC,ACTG1,MACF1和DYNC1N1（圖1B），而分泌蛋白分別為COL1A1,COL1A2,C3,FN1,FLNA,ACTN4,FLNC,FBN1,AGRN和LAMB1（圖1C）。
為了進(jìn)一步描述hRPE細(xì)胞的特征，作者進(jìn)行了PANTHER和GO亞細(xì)胞定位分析。PANTHER分析表明，細(xì)胞內(nèi)蛋白包括代謝物相互轉(zhuǎn)化酶，核酸結(jié)合蛋白和蛋白質(zhì)修飾酶（圖1D）。GO亞細(xì)胞定位分析表明，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白屬于膜，細(xì)胞核和囊泡。此外，作者還量化了93種視網(wǎng)膜中未鑒定到的蛋白質(zhì)（圖2E）。
3.衰老過(guò)程中hRPE蛋白質(zhì)組學(xué)特征的變化
為了闡明hRPE分子功能變化與衰老之間的關(guān)系，作者使用蛋白質(zhì)聚類分析鑒定與衰老相關(guān)亞型（圖2A），共鑒定到10個(gè)簇（C1-C10）。其中，簇C1,C5和C6蛋白富集通路在Y和M組相對(duì)穩(wěn)定而在O組發(fā)生顯著變化。在O組中，C1相關(guān)通路上調(diào)而C5和C6相關(guān)通路下調(diào)。因此，簇C1,C5,C6和C7蛋白富集的通路可能與衰老相關(guān)RD的病理過(guò)程密切相關(guān)。
為了進(jìn)一步分析不同階段（O vs Y，M vs Y和O vs M）之間的關(guān)系并解釋衰老過(guò)程對(duì)hRPE的影響，作者進(jìn)行GSEA分析。O vs Y和O vs M具有類似的富集模式（圖2B），說(shuō)明這些蛋白質(zhì)在O期發(fā)生了明顯變化，這可能是RPE相關(guān)疾病在老年時(shí)容易發(fā)病的原因。此外，在衰老過(guò)程中hRPE細(xì)胞在某些過(guò)程下調(diào)而在其他過(guò)程上調(diào)。
4.衰老相關(guān)蛋白和功能
為了鑒定hPRE細(xì)胞中與衰老相關(guān)的蛋白，作者計(jì)算不同分組中蛋白的皮爾森相關(guān)系數(shù)。將r閾值設(shè)置為0.5，P閾值設(shè)置為0.05，在Y vs O分組下有46個(gè)蛋白上調(diào)和35個(gè)蛋白下調(diào)（圖3C）。隨后，作者對(duì)這些蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析表明FMNL3,COL18A1,ATPIF1和ERAP1等下調(diào)蛋白有助于血管生成（圖3D），RNF149,RNF123,FBXO9,PCNP和MALT1等上調(diào)蛋白參與蛋白質(zhì)泛素化（圖3D）。PRKCA,PRKCI,BCAR1,GNAI2和TIGB3參與RAP1信號(hào)通路（圖3E）。
5.RNF123,RNF149和蛋白質(zhì)泛素化可以保護(hù)RPE在衰老過(guò)程中免受氧化損傷
為驗(yàn)證作者蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性并解釋RNF123,RNF149，泛素化蛋白與衰老之間的關(guān)系，作者進(jìn)行蛋白質(zhì)印記分析（WB）。作者發(fā)現(xiàn)RNF123,RNF149和泛素化蛋白水平會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加（圖3A和3B）。為驗(yàn)證RNF123,RNF149和相關(guān)泛素化蛋白在RPE衰老過(guò)程中的作用，作者分析使用梯度濃度的氧化損傷誘導(dǎo)劑（H2O2和D-gal）處理的ARPE-19和HEK293T細(xì)胞。WB結(jié)果表明，RNF123,RNF149和泛素化蛋白的水平隨D-gal和H2O2濃度的增加而增加。然而，這種現(xiàn)象會(huì)被一種天然抗氧化劑葉黃素逆轉(zhuǎn)（圖3C和3D）。接下來(lái)，作者使用具有一定濃度梯度的H2O2處理Y組和O組的hRPE細(xì)胞。CCK8活力結(jié)果表明，O組的hRPE細(xì)胞更易氧化損傷。WB結(jié)果表明，氧化損傷與蛋白質(zhì)泛素化上調(diào)有關(guān)。為了研究RNF123,RNA149與蛋白質(zhì)泛素化水平之間的關(guān)系，結(jié)果表明，RNF123和RNF149過(guò)表達(dá)會(huì)顯著增加ARPE-19和HEK293T細(xì)胞中蛋白質(zhì)泛素化水平。這種現(xiàn)象同樣可以使用葉黃素逆轉(zhuǎn)（圖3E和3F）。為研究RNF123和RNF149在RPE細(xì)胞中的功能，作者研究RNF123和RNF149過(guò)表達(dá)猴ARPE-19細(xì)胞對(duì)氧化損傷的耐受性。活力分析表明，過(guò)表達(dá)RNF123和RNF149后，ARPE-19細(xì)胞對(duì)H2O2的敏感性降低（圖3G）。由于，活性氧（ROS）的積累是細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo)。因此，作者定量H2O2處理的ARPE19細(xì)胞的ROS水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)RNF123和RNF149會(huì)到時(shí)ROS水平顯著降低（圖3H）。總的來(lái)說(shuō)，ARPE-19細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RNF123和RNF149 會(huì)抑制H2O2誘導(dǎo)生成的ROS水平。HEK293T細(xì)胞的結(jié)果與之類似。此外，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志物。作者進(jìn)一步定量過(guò)表達(dá)RNF123和RNF149后H2O2處理的ARPE-19細(xì)胞中SA-β-gal水平的變化。結(jié)果表明，SA-β-gal水平在H2O2處理的細(xì)胞中顯著增加（圖3I），然而過(guò)表達(dá)RNF123和RNF149后SA-β-gal水平降低。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)RNF123和RNF149會(huì)減少細(xì)胞在衰老過(guò)程中的氧化損傷，這與泛素化水平變化有關(guān)。因此，RNF123和RNF149和相關(guān)蛋白泛素化可能在保護(hù)RPE免受氧化損傷中發(fā)揮重要作用。
6.衰老相關(guān)的分泌表型和蛋白質(zhì)
為鑒定與衰老相關(guān)的分泌表型，作者對(duì)分泌蛋白進(jìn)行聚類分析，共鑒定到9個(gè)簇（C1-C9）（圖4A）。簇2中蛋白質(zhì)富集的通路隨年齡增長(zhǎng)而上調(diào)，這些通路與凋亡信號(hào)通路有關(guān)（圖2D）。然而，簇C9中蛋白富集的細(xì)胞組分組織和ER組織通路隨年齡增長(zhǎng)而下調(diào)。隨后，作者進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析，有38種蛋白上調(diào)和16種蛋白下調(diào)（圖4B）。
7.與衰老相關(guān)的分泌蛋白網(wǎng)絡(luò)改變
作者對(duì)分泌蛋白進(jìn)行WGCNA分析，共鑒定到15個(gè)模塊（圖4C），相關(guān)性分析表明M7和M11模塊與衰老正相關(guān)，M9與衰老負(fù)相關(guān)。隨后，作者對(duì)模塊M7,M9和M11進(jìn)行KEGG和GO富集分析。KEGG富集分析表明，M7和M11富集于RNA相關(guān)通路，泛素介導(dǎo)的蛋白水解，核苷酸切除修復(fù)等（圖4D），M9富集于丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝和精氨酸生物合成等通路。GO富集分析表明，M7的核糖體結(jié)構(gòu)組分，M11的翻譯調(diào)節(jié)活性及M7和M11的結(jié)合相關(guān)過(guò)程會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而上調(diào)。然而，酶活性，NAD結(jié)合和輔酶結(jié)合會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而下調(diào)。
8.衰老過(guò)程中hRPE細(xì)胞中特異性改變的分泌蛋白
由于，分泌蛋白的特異性改變可能對(duì)衰老過(guò)程中細(xì)胞間通訊十分重要。因此，作者接下來(lái)分析了hRPE細(xì)胞中共有的細(xì)胞內(nèi)蛋白和分泌蛋白，共有2067個(gè)。其中有147個(gè)分泌蛋白發(fā)生顯著變化，包括IMPAD1,CPD,RMDN3,MGAT1,MYEF2和PAPOLA（圖5A）。使用Cytoscape中ClueGo軟件對(duì)特異性改變的分泌蛋白進(jìn)行功能富集分析，共鑒定到108個(gè)顯著富集的GO 功能（圖5C）。這些生物學(xué)過(guò)程可能在RPE的細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。
總結(jié)：
RPE在滋養(yǎng)和支持神經(jīng)視網(wǎng)膜方面發(fā)揮重要作用，在衰老相關(guān)的視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。在這篇文章中，作者全面描述了hRPE細(xì)胞的蛋白質(zhì)組和分泌組特征。此外，作者還揭示了hRPE在衰老過(guò)程中的變化并鑒定與衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)及其相關(guān)功能。總的來(lái)說(shuō)，作者的研究描述了人類RPE在衰老過(guò)程中的詳細(xì)分子特征，有助于未來(lái)RPE和相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的研究。
