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每年約有15萬人死于膀胱癌，其中約有70%-80%的患者為非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）。目前，已經開發了多種治療NMIBC的方法但是很多患者對治療無效。因此，鑒定NMIBC的治療靶點和預后因子十分重要。今天就給大家介紹一篇發表在eBioMedicine（IF：11.205）研究NMIBC預后因子的文章“YAP1 activation is associated with the progression and response to immunotherapy of non-muscle invasive bladder cancer”。這篇文章中作者重點關注在腫瘤發生發展中十分重要的基因YAP1。作者通過UC3-siYAP1細胞和NMIBC隊列數據鑒定YAP1相關的基因特征，結果表明YAP1激活與高危NMIBC患者的特征和免疫治療反應有關。
流程圖：
結果：
1.篩選膀胱癌細胞系進行分析和驗證
首先作者分析了MCF10A乳腺上皮細胞系的RNA-seq數據集并篩選2151個與YAP1過表達相關的基因。使用這些基因對MCF10A數據集進行水平聚類共鑒定到2個亞組（圖1A）。隨后，在4個細胞系中分析與YAP1激活有關的基因（圖1a和1b）。與細胞系RT4相比而言，基因YAP1，CYR61，CTGF和TEAD2在細胞系UC14，T24和UC3中的表達水平升高，而基因FGFR3的表達水平顯著降低（圖1c）。轉染YAP1-S127A后，細胞系RT4和UC14細胞系中CYR61,CTGF和TEAD2的表達水平升高而FGFR3的表達水平降低。轉染siYAP1后，細胞系UC3和T24細胞系中，CYR61，CTGF和TEAD2的表達水平顯著降低而FGFR3的表達水平增加。以上結果表明，細胞系UC3適合進行下一步實驗研究YAP1表達后下游基因的表達趨勢。
2.根據YAP1激活情況將NMIBC患者分為亞組
作者使用轉染siYAP1的UC3膀胱癌細胞系的RNA-seq數據集鑒定到549個YAP1失活有關的差異表達基因，包括50個最顯著差異表達基因。將這50個差異基因與UROMOL隊列數據結合并進行K-means分析。其中siYAP1-轉染細胞和YAP1失活患者聚為一類而siCon-轉染細胞和YAP1激活患者聚為一類。然而，這50個基因僅能表明YAP1在細胞實驗條件下被激活而不是與NMIBC患者相關的生物學特征。因此，作者使用t檢驗評估UROMOL隊列的基因表達數據，在UROMOL數據集的YA亞組和YI亞組鑒定到976個差異表達基因。
使用這976個基因進行一致性聚類將NMIBC患者分為三組，分別為YA1，YA2和YI亞組。
3.YAP1激活與NMIBC患者的無進展生存期和膀胱內治療（IVT）受益顯著相關
在各個亞組的激活信號通路中鑒定到32個基因（圖2a），與YI亞組相關的7個基因具有管腔乳頭特征，與YA1亞組相關的10個基因參與DNA損傷和修復通路，與YA1和YA2亞組相關的6個基因參與上皮-間質轉化和TGFβ通路激活。許多高危膀胱癌患者，如T1期和高級別，被納入YA1亞組。此外，UROMOL隊列的第2類被細分為YA1和YA2亞組。（圖2a）。KM分析表明YA1亞組的進展率高于YA2和YI亞組（圖2b）。多因素分析表明，YA1亞組無進展生存期的重要指標包括分期，分級和在UROMOL隊列中的976個基因的signature。IVT會顯著影響YA1亞組的無進展生存期（圖2c）而不會影響YA2和YI亞組（圖2d和2e）。
4.驗證YAP1激活對膀胱癌患者的預后價值
作者結合Lund和Korean兩個隊列的NMIBC患者的基因表達和臨床數據創建新的隊列驗證YAP1激活與患者預后的相關性。與上述結果一致，NMIBC高危患者被納入YA1和YA2亞組。YA1和YA2亞組患者的進展率顯著高于YI亞組。多因素分析表明YA1亞組無進展生存的重要指標包括分期，分級和976個基因的signature。
5.實驗驗證YAP1激活
接下來，作者使用YAP1基因敲除實驗研究基因YAP1對UC3細胞增殖和活力的影響，并進行體外驗證。作者主要使用兩種siRNAs分別為siYAP1#1和siYAP1#2，生成了YAP1的轉錄水平和蛋白水平均降低70%的細胞。結果表明，與轉染scRNA細胞相比，siYAP1轉染的細胞存活率、增殖形成、侵襲性和遷移率均有所降低。此外，CCNA2，TEAD2，CTGF，CYR61，SMAD3和SMAD6在UC3細胞系中的表達水平有所改變。此外，CTGF，CYR61和CCNA2的蛋白水平有所降低。以上結果表明，在穩定條件下研究表型變化和基因表達水平變化是合理的。使用穩定轉染shRNA-YAP1的UC3細胞系（shYAP1），生成YAP1轉錄水平和蛋白水平均降低的細胞系（圖3a）。與shNTS細胞相比，shYAP1細胞的存活率、集落形成、侵襲性和遷移性均降低（圖3b和3c）。在shYAP1中，YA1和YA2亞組的相關基因表達水平降低而YI亞組相關基因表達水平升高（圖3d）。此外，CTGF，CYR61，E2F1和FOXM1蛋白水平有所降低（圖3e）。然而，將YAP1載體轉染到shYAP1細胞后，亞群相關基因的表達水平有所恢復（圖3f）。以上結果表明，YAP1基因下調表達會抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移，并且與YA1和YA2亞群相關基因的表達有關。
6.與免疫治療反應相關的綜合分析和臨床特征分析
接下來，作者綜合分析IMvigor210數據集和UROMOL數據集研究YAP1激活如何影響免疫治療的反應。基于代表每個亞組的32個選定基因，之前的基因表達譜分析是一致的（圖4a）。KM分析表明，接受PD-L1免疫治療的YA1亞組患者生存期有所延長（圖4b）。隨后，作者研究各個亞組和客觀緩解率（ORR），其中YA1亞組的ORR高于YA2和YI亞組（圖4c）。
在YA1亞組中免疫細胞和腫瘤細胞的PD-L1蛋白相對高表達（圖5a和5b）。YA1和YI亞組的腫瘤突變負荷（TMB）具有顯著差異（圖5c）。基于TCGA分型，大部分管腔型，基底型和神經元型包括在YA1亞組中，管腔浸潤亞型包括在YA2亞組中，管腔乳頭亞型被納入YI亞組（圖5d）。在Lund分型中，基因組不穩定（GU）亞型在三個亞組中比例類似，YA1亞組主要包括基底/SCC樣和尿基B亞型，YA2亞組主要包括浸潤亞型，YI亞組主要包括尿基底A亞型（圖5e）。UROMOL隊列的第2類被分為YA1和YA2亞組，而UROMOL隊列的第1類和第3類被納入YI亞組（圖5f）。此外，大多數NMIBC高危患者被納入YA1亞組（圖5g和5h）。以上結果表明，基于這976個基因對TCGA和UROMOL數據集進行綜合分析，可以研究YAP1激活如何影響MIBC患者的預后。
結論：
總的來說，作者鑒定到NMIBC的三個亞組并研究YAP1激活，YAP1激活在不同亞組患者的進展中具有顯著差異。作者的研究為NMIBC患者接受手術后各種治療反應的生物學決定因素提供額外見解，有助于通過劃分不同患者亞組進行精準治療。
