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今天小編給大家解讀一篇今年12月發(fā)表在Advanced Science雜志（IF: 17.521）的文章“The Single-Cell Landscape of Intratumoral Heterogeneity and The Immunosuppressive Microenvironment in Liver and Brain Metastases of Breast Cancer”。
轉(zhuǎn)移仍然是乳腺癌死亡率較高的主要原因。其中，肝或腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后非常差，PD-1/L1免疫檢查點治療的應(yīng)答率也很低。因此，迫切需要研究抗PD-1/L1耐藥的潛在機制，為這些患者制定更有效的免疫治療策略。作者使用單細(xì)胞RNA測序的44473個細(xì)胞描繪了整個腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。剖析了乳腺癌肝腦轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)的異質(zhì)性和免疫抑制微環(huán)境。
為了破譯乳腺癌肝和腦轉(zhuǎn)移腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，作者對轉(zhuǎn)移病灶進行了單細(xì)胞RNA測序。然后，無監(jiān)督聚類分析，確定了具有相似表達(dá)模式的主要細(xì)胞簇(圖1b-e)。進一步進行了多重免疫熒光染色，確認(rèn)乳腺癌肝臟和腦轉(zhuǎn)移組織中的細(xì)胞亞群(圖1f,g)。
為了評估乳腺癌肝和腦轉(zhuǎn)移病灶中的免疫抑制微環(huán)境，檢測了每個細(xì)胞亞群中免疫檢查點分子的表達(dá)(圖2c)。發(fā)現(xiàn)LAG3, TIGIT, CD96, 和KLRB1在T細(xì)胞中的表達(dá)高于PDCD1。相應(yīng)的免疫檢查點配體CD274和PDCD1LG2在腫瘤微環(huán)境中的癌細(xì)胞或其他浸潤細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。其他免疫檢查點配體NECTIN2、LGALS3、和LGALS9在癌細(xì)胞或其他浸潤細(xì)胞中高表達(dá)(圖2d)。這些結(jié)果表明PD-1受體和PD-L1/2配體對可能不是乳腺癌肝和腦轉(zhuǎn)移的主要免疫檢查點信號通路分子。因此，靶向LAG3-LGALS3和TIGIT-NECTIN2可能是治療乳腺癌肝和腦轉(zhuǎn)移的有效策略。
接下來，用InferCNV法區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞。在乳腺癌、肝和腦轉(zhuǎn)移瘤識別了13個主要的癌細(xì)胞亞群(圖3a-c)。為了研究來自多個樣本的癌細(xì)胞之間的共同表達(dá)模式，建立了一個meta-cluster算法。確定了六種不同細(xì)胞狀態(tài)和生物學(xué)功能的常見表達(dá)程序，包括增殖維持、轉(zhuǎn)移激活、免疫逃避、應(yīng)激抵抗、代謝重編程和促進炎癥(圖3d，e)。進行相關(guān)性分析識別出三個顯著的共存程序?qū)σ约熬艂€相互排斥的程序?qū)?圖3i)。TOP表達(dá)的程序基因KLF5可能成為抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點。KLF5抑制劑可能成為未來抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的有效藥物。
根據(jù)肝轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)基因，分別識別了7個和5個癌細(xì)胞亞群(圖3j)。利用hallmark信號通路進行富集分析，探索每種細(xì)胞的潛在生物學(xué)功能和相關(guān)的信號通路(圖3k,l)。
乳腺癌在很大程度上是由基因拷貝數(shù)的變化驅(qū)動的。推斷的CNV圖譜顯示了肝和腦轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中病變間和病變內(nèi)的異質(zhì)性(圖4a-c)。在每個患者的亞克隆中都發(fā)現(xiàn)了多個規(guī)范的(CNV百分比大于90%)和非規(guī)范的(CNV百分比小于90%)CNV，這些CNV在癌細(xì)胞進化的細(xì)胞群體的亞克隆中被發(fā)現(xiàn)(圖4d)。癌細(xì)胞亞群c8_TOP2A、c9_HMGB2、c12_MKI67和c13_TK1主要處于循環(huán)狀態(tài)，而c1_TCN1、c2_CD74、c3_CD24、c5_CEACAM6和c10_SAT1主要處于靜止?fàn)顟B(tài)(圖3g,h)。Monocle2和RNA velocity對癌細(xì)胞進行了軌跡分析還剖析了與癌細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變有關(guān)的基因模式的變化(圖4i,f,j,k)。接著，作者評估了每個癌細(xì)胞群的干性(圖4l,m)。此外，還研究了免疫檢查點配體在每個癌細(xì)胞亞群中的表達(dá)。最有希望的免疫檢查點治療靶點CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)在每個癌細(xì)胞群體中的表達(dá)水平較低(圖4n,o)。另外兩個免疫檢查點配體NECTIN2和LGALS3幾乎在所有的亞群中都有高表達(dá)。這些表面蛋白有望成為未來肝臟和腦轉(zhuǎn)移乳腺癌治療的免疫靶點。
之后，作者分別對T細(xì)胞和B細(xì)胞進行重組，確定了13個T細(xì)胞和先天淋巴亞群(圖5a，b)。在四個CD8+T細(xì)胞中2個cluster高表達(dá)免疫檢查點分子TIGIT、LAG3、CD96。B細(xì)胞重新聚集后，確定了四個主要亞群 (圖5c,d)。CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出相對高水平的共刺激分子，包括ICOS和TNFRSF4，這對CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性刺激很重要(圖5f，g)。CD8+T細(xì)胞高表達(dá)GZMB、GZMK、和GZMH等細(xì)胞毒基因。數(shù)據(jù)還顯示，這些CD8+ T細(xì)胞亞型表達(dá)T細(xì)胞衰竭相關(guān)抑制受體，包括LAG3、TIGIT和CD96，表明這些CD8+ T細(xì)胞在乳腺癌肝和腦轉(zhuǎn)移的初始激活步驟后就衰竭了(圖5f，g)。CD8_T_cells_c1_GZMK和CD8_T_cells_c4_IFIT3的功能紊亂得分顯著高于其他兩個集群。此外，CD8_T_cells_c1_GZMK簇在腦轉(zhuǎn)移癌中的功能紊亂評分高于肝轉(zhuǎn)移癌(圖5h,i)。
GO和KEGG分析了每種類型細(xì)胞潛在的生物學(xué)功能和相關(guān)的信號通路(圖5j,k)。為了追蹤CD8+T細(xì)胞的分化，進行了偽時序分析。CD8_T_cells_c1_GZMK簇的終末狀態(tài)最多，偽時序得分最高，揭示了CD8_T_cells_c2_ZNF683和CD8_T_cells_c3_KLRB1簇處于中間狀態(tài)(圖5l)。在B細(xì)胞的偽時序軌跡分析中，Plasma_cells_MZB1簇處于最末期，具有最高的偽時序分?jǐn)?shù)(圖5m)。接下來，檢測了CD8+T細(xì)胞亞群中免疫檢查點受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LAG3、TIGIT、CD96、a d KLRB1(CD161)的表達(dá)高于PDCD1(PD-1)(圖5n-p)。
CellphoneDB預(yù)測了癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間相互作用。Treg細(xì)胞與其他細(xì)胞群體的相互作用最多，表現(xiàn)出與癌細(xì)胞的強烈相互作用(圖6f)。癌細(xì)胞通過CXCL10-CXCR3配體-受體對招募了CD4_T_Cells_c2_CXCL13、CD8_T_Cells_c1_GZMK、CD8_T_Cells_c4_IFIT3、NK_Cells_KLRD1和T reg_Cells_FOXP3簇(圖6g)。參與細(xì)胞間通訊的其他重要配體-受體對如圖6h所示。
髓系細(xì)胞可分為20個簇(圖7a-d)。單核細(xì)胞形成兩個簇：Mono_c1_VCAN和Mono_c2_FCN1。TAMs有12個簇，可分為M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和增殖性巨噬細(xì)胞。M1-TAMs與炎癥因子相關(guān)，包括CCL2/3/4、CXCL3和TNF，在腫瘤微環(huán)境中募集T細(xì)胞、未成熟DC和NK細(xì)胞。M2-TAMs是促進腫瘤的巨噬細(xì)胞，高表達(dá)MRC1、CD163。此外，M2類TAMs的免疫檢查點分子PD-L1、PD-L2、LGALS3、LGALS9的表達(dá)均高于M1類TAMs。分析了TAM成熟的軌跡，并確定了TAM狀態(tài)轉(zhuǎn)換中涉及的基因表達(dá)模式的變化(圖7f-h)。
DC由四個簇組成：常規(guī)DC、耐受樹突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞。cDCs是成熟的DCs，可以激活CD8+T細(xì)胞和其他抗腫瘤免疫反應(yīng)，并且高表達(dá)共刺激因子、MHC II類分子和促炎細(xì)胞因子(圖7i)。LAMP3-positive tDCs是樹突狀細(xì)胞的一個免疫抑制亞群，它們高水平表達(dá)幾種陰性免疫調(diào)節(jié)因子，包括IDO1，CCR7，LGALS3，LGALS9，和NECTIN2(圖7i，k)。GO和KEGG探索每種細(xì)胞類型的潛在生物學(xué)功能和相關(guān)的信號通路(圖7j)。根據(jù)CellphoneDB分析，腫瘤微環(huán)境中，TAMS與癌細(xì)胞和其他髓系細(xì)胞的相互作用最多(圖7l)。
在間質(zhì)間隔中發(fā)現(xiàn)了三種主要的細(xì)胞類型：CACs、ECs和MCs(圖8a-d)。CAF被聚為四個亞群；ECs分為四個亞群；MCs可分為五個亞群(圖8g)。主成分分析和diffusion map揭示了CAFs_c2_DCN的兩種不同的演化軌跡，最終發(fā)展為炎癥性CAF簇(圖8h)。動脈內(nèi)皮細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育而來，參與轉(zhuǎn)移灶的動態(tài)血管生成過程(圖8i)。Mural_cells_c2_COL1A1細(xì)胞發(fā)育成兩個分支，且這些分支中的Mural_cells_c4_MYH11和Mural_cells_c5_RGS5簇具有最高的偽時序分?jǐn)?shù)，代表最分化和成熟的MC(圖8j)。
接下來，檢查了免疫檢查點配體在每個癌細(xì)胞亞群中的表達(dá)。幾個免疫檢查點分子在三種基質(zhì)細(xì)胞亞型中高度表達(dá)，包括LGALS3，LGALS9，NECTIN2，和TNFRSF14(圖8k)。根據(jù)CellphoneDB分析，CAFs_c2_DCN, ECs_c1_GJA5,和Mural_cells_c2_COL1A1分別是CAF、ECs和MC與癌細(xì)胞相互作用最多的細(xì)胞。
不同的CAF亞群有不同的生長因子分泌模式(圖8l)。提示CAF可產(chǎn)生VEGFRA/B，與內(nèi)皮細(xì)胞上的血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合，促進血管生成。基于細(xì)胞生長因子和受體對，構(gòu)建了CAF和癌細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CAFs_c2_DCN亞群通過FGF2/7-FGFR3/4和IGF1-IGF1R信號通路促進癌細(xì)胞生長(圖8m)。特別是，RGS5+腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞簇被發(fā)現(xiàn)，并證明通過分泌Periostin和Biglycan來負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)移性乳腺癌的免疫過程。
駐留細(xì)胞(微膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、肝細(xì)胞等)是腦或肝轉(zhuǎn)移微環(huán)境不可缺少的組成部分，參與形成獨特的定殖生態(tài)位和免疫環(huán)境。共鑒定了13個細(xì)胞群，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞、肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞(圖9a-e)。小膠質(zhì)細(xì)胞Microglials_c1_CCL4通過分泌趨化因子如CCL3/4在腫瘤微環(huán)境中募集T細(xì)胞、未成熟DC和NK細(xì)胞，從而促進免疫應(yīng)答。Microglials_c2_LGALS1表達(dá)高水平的Galectin-1，可能通過CD8+T細(xì)胞排斥形成免疫抑制的微環(huán)境。此外，免疫檢查點基因SELPLG和LGALS3在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，而FGL1、NECTIN2、和LGALS3在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中高表達(dá)(圖9f-h)。
在本研究中，作者對肝和腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌樣本進行了高分辨率分析，確定了不同的主要細(xì)胞類型，包括癌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和器官特異性駐留細(xì)胞。分析每個細(xì)胞團的分子特征、調(diào)節(jié)因子、動力學(xué)和功能，探討它們在轉(zhuǎn)移性腫瘤進展和免疫逃逸中的作用。在癌細(xì)胞中鑒定出六種不同細(xì)胞狀態(tài)和生物學(xué)功能的共同表達(dá)程序，包括增殖維持、轉(zhuǎn)移激活、免疫逃避、應(yīng)激抵抗、代謝重編程和促進炎癥。總之，該研究揭示了肝和腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性和免疫抑制腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，這為深入了解免疫檢查點治療抵抗的機制提供了信息，并為這些患者開發(fā)精確的免疫治療策略提供了信息。
