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單細胞是目前炙手可熱的話題，目前關(guān)于各類疾病的單細胞數(shù)據(jù)分析文章數(shù)不勝數(shù)，生信人也一直在推出與之相關(guān)的分析思路。今天小編再和大家分享一篇這個月新鮮出爐的一篇12+文章，發(fā)表在CLINICAL CANCER RESEARCH（IF: 12.658）。高級別漿性卵巢癌(HGSOC)是卵巢癌中死亡率較高的一種表型，一般發(fā)現(xiàn)時已到晚期。小編今天和大家介紹的這篇文章就詳細描述了臨床早期和晚期原發(fā)HGSOC腫瘤上皮細胞發(fā)育等級，并鑒定了EMT的特性。結(jié)合濕實驗鑒定了TIGIT阻滯劑在卵巢癌中的治療價值。
背景：
我們都知道卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，而高級別漿性卵巢癌(HGSOC)約占所有卵巢癌死亡率的80%。由于癥狀不明確，這種惡性腫瘤只有20%的病例可以在早期階段被識別出來并成功治療。患者預(yù)后較差，即使在治療后，HGSOC也經(jīng)常因化療耐藥而復發(fā)，總體5年生存率為31%。
HGSOC有幾個特點。其中之一是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，這是卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移以及化療耐藥的主要機制。激活EMT轉(zhuǎn)錄程序的HGSOC患者預(yù)后較差。另一個特點是腫瘤的異質(zhì)性，其特征是腫瘤微環(huán)境。已有很多工作在分析HGSOC的腫瘤微環(huán)境。一種調(diào)節(jié)TME的方法是通過調(diào)節(jié)免疫細胞行為，PD-L1已被研究用于卵巢癌的免疫治療，但效果有限。一個主要原因是PD-L1只在大約1.3%的卵巢上皮癌患者中表達上調(diào)，這表明這種方法不能適用于大多數(shù)卵巢癌患者。因此，通過scRNA-seq揭示HGSOC不同階段的細胞特征是非常有益的，它為開發(fā)針對特定疾病階段的合適的免疫治療提供了更準確的信息。
結(jié)果解讀：
原發(fā)HGSOC腫瘤和非惡性卵巢的單細胞圖譜分析
作者對12例未接受治療的患者卵巢細胞進行了深入的scRNA-seq分析，其中包括7例HGSOC患者和5例年齡匹配的非惡性卵巢患者（圖1 A）。腫瘤細胞33,264個，非惡性細胞26,060個。圖1 B和C主要展示了細胞的UMAP圖和各類細胞的marker基因。然后作者使用KEGG和GO注釋每個細胞群的功能特征。作者將細胞群與臨床分期等腫瘤特征聯(lián)系起來。隨著腫瘤分期的進展，T細胞的比例逐漸降低（圖1 E）。
圖1
不同階段腫瘤的上皮細胞特征
用R包INFERCNV分析每種細胞類型的體細胞拷貝數(shù)變異(CNV)，并確定CNV大于0.05且CNV相關(guān)性大于0.5的惡性上皮細胞。總共收集了14,636個卵巢上皮細胞，并將其分為12個不同的簇（圖2 A,B）。然后應(yīng)用CytoTRACE預(yù)測這些上皮細胞的分化狀態(tài)，鑒定出HGSOC中的靜止干細胞。大多數(shù)負責免疫檢查點抑制的配體基因在腫瘤Ⅰ期富集，但在腫瘤晚期顯著減少。PD-1和CTAL-4配體基因CD274 (PD-L1)和CD80/86 (B7-1/2)在HGSOC各個階段的表達水平均較低。
接著作者進行偽時序分析。在基因表達相似性的基礎(chǔ)上分成11個細胞簇，并被投射到HGSOC basic, stage 2, 和stage 3的偽時序過程中，并做了通路富集。作者發(fā)現(xiàn)沿著這個軌跡，簇1細胞在stage 3的基因特征被表征為特定的功能通路，包括PI3K-AKT信號通路、松弛因子信號通路、細胞凋亡和Rap1信號通路。還表達了一組EMT相關(guān)基因。
38個EMT標記物在HGSOC細胞與非惡性對照細胞中差異表達。為接著使用TCGA和GEO數(shù)進行生存分析NOTCH1、SNAI2、WNT11、和TGFBR1四個基因與不良結(jié)果顯著相關(guān)（圖2 F）。免疫熒光分析進一步證實了其他EMT標記基因CDH1和VIM在HGSOC組織中的存在，結(jié)果表明有一組強大的細胞具有潛在的EMT功能（圖2 G）
圖 2
基質(zhì)間充質(zhì)干細胞的多樣性及CAF的特征
接著作者查看了成纖維細胞，成纖維細胞聚集成了14個細胞簇。非惡性成纖維細胞分為三個亞群（圖3 A,B）。在惡性成纖維細胞中，mCAF是HGSOC腫瘤中的主要CAF。mCAF標記基因的高表達與較差的患者預(yù)后相關(guān)。染色顯示晚期HGSOC的mCAF對CAF標志物a-SMA、vientin和COL3A以及mCAF標志物COL10A和MMP11呈陽性反應(yīng)（圖3 F）。作者為了驗證mCAF是否具有促EMT特性，做了實驗驗證。CAF/卵巢癌細胞(A2780或OVCAR3) Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中，間充質(zhì)生物標記物如ZEB1、vimentin和Snail蛋白水平上調(diào)，腫瘤細胞侵襲增加，說明這些mCAF具有某些促EMT特性(圖3 G,H)。
圖3
巨噬細胞M1增多，HGSOC早期預(yù)后良好
接著作者又將巨噬細胞重新聚類，其中包含M1、MDSC和M2這些比較經(jīng)典的巨噬細胞。
然后作者在HGSOC組織中檢測巨噬細胞與其他免疫細胞類型相互作用的能力。單核細胞、B細胞、T細胞和NK細胞的遷移程度在腫瘤晚期減弱，表明巨噬細胞失去了對其他免疫細胞的吸引力。相反，許多代表巨噬細胞分泌生長因子的基因在腫瘤晚期顯著誘導(圖4C)。這些結(jié)果表明，巨噬細胞在這一過程中經(jīng)歷了惡性轉(zhuǎn)化。在早期stage 1，巨噬細胞有很強的招募免疫細胞的能力， stage 1可能更適合調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)(圖4C)。
圖4
圖5
浸潤性CD8+ T細胞狀態(tài)是HGSOC TME中跨隔室相互作用形成的
除了巨噬細胞外，HGSOC腫瘤中淋巴細胞的特征和分布也與非惡性組織相比有所不同。免疫組織化學證實HGSOC和非惡性卵巢組織中有浸潤性淋巴細胞的存在(圖5A)。由于T細胞系攜帶CD8A基因濃縮(圖1C)，作者通過CD8A抗體的IF分析證實了它在HGSOC腫瘤中的存在(圖5B)。將CD8A+ T細胞重新分組為9個簇，而這些簇在組織中的分布有所不同。
作者重點研究了HGSOC組織中豐富的兩種細胞類型，包括CD8+ TRM和CD8+ TEX細胞。圖5E顯示CD8+ TEX細胞數(shù)量在早期較高，但在晚期較少。CD8+ TRM細胞在早期HGSOC腫瘤中發(fā)揮局部免疫保護作用。生存因子的表達，如IL15、IL17和NOTCH配體，這些已知決定TRM細胞的形成和持久性。其中IL15在HGSOC來源的惡性上皮細胞中表達，并誘導CD8+ TRM細胞和CD8+ TEX細胞的形成。除上皮細胞外，HGSOC腫瘤中的M1巨噬細胞主要表達CXCL9和CXCL10，通過CXCL9/CXCL10-CXCR3相互作用招募CD8+ TRM細胞(圖5G)。CD8+ TRM細胞的signature與改善患者生存顯著相關(guān)。
TIGIT阻滯劑在卵巢癌發(fā)生中的作用
免疫共抑制受體TIGIT調(diào)節(jié)抗腫瘤CD8+ T細胞反應(yīng)，在我們的研究中CD8+ TEX細胞也高表達TIGIT。那么TIGIT是否有助于卵巢癌的生長？作者進行了實驗驗證，給8只雌性C57BL/6小鼠皮下注射ID8細胞。8周后，接受抗TIGIT或同型相合對照抗體治療(圖6A)。抗TIGIT治療的小鼠顯示出腫瘤負荷的減少，如腫瘤生長緩慢、腫瘤體積和腫瘤重量降低。TIGIT阻斷顯著抑制腫瘤中TIGIT+ -CD8+T細胞的頻率(圖6 F,G)。這些結(jié)果表明，抗TIGIT抗體對CD8 T細胞的TIGIT中和作用可減輕ID8荷瘤小鼠的腫瘤負荷。
圖6
總結(jié)：
這篇文章從HGSOC單細胞圖譜入手，描繪了HGSOC在早期或晚期的生態(tài)系統(tǒng)格局，重點是它與TME的異質(zhì)性。從不同角度分析了惡性上皮細胞、基質(zhì)細胞、巨噬細胞、T細胞的功能及細胞間的相互作用。作者主要發(fā)現(xiàn)了四個EMT基因模型，可以預(yù)測HGSOC患者預(yù)后；mCAF增強卵巢癌細胞侵襲的能力以及抗TIGIT治療的潛在治療價值。
