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肺癌耐藥機制的多組學分析
肺癌是一種高風險惡性腫瘤。非小細胞肺癌(NSCLC)中表皮生長因子受體(EGFR)的突變使EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)成為一個有吸引力的治療選擇。然而，患者通常會對EGFR-TKI產生耐藥性并影響腫瘤的免疫浸潤，導致患者生存不良。而其分子變異尚不完全清楚，需要進一步研究。今天小編給大家分享一篇2022年2月2日發表在Journal of Inflammation Research（IF：6.922）上的文章，看看這篇文章是如何利用多組學分析來研究肺癌的耐藥機制的吧！
研究背景
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，約 80% 的肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。晚期 NSCLC 的治療效果并不理想，但是有研究發現EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)在無進展生存期和緩解率方面優于化療。TKI和化療聯合使用可能會進一步提高肺癌的總體生存率。然而，患者在服用 TKI 約 9 到 14 個月后會出現耐藥性。雖然已經發現了一些與耐藥相關的改變，但1代或2代 EGFR-TKI的耐藥機制（吉非替尼、阿法替尼等）仍不完全清楚。因此，迫切需要一些新的生物標志物來預測EGFR-TKI耐藥性，并促進臨床實踐中的最佳治療選擇。
腫瘤微環境中與癌癥相關的免疫細胞浸潤可能導致腫瘤生長、轉移和治療抵抗。 EGFR-TKI可以調節EGFR突變的NSCLC患者的腫瘤浸潤免疫細胞，治療后的腫瘤浸潤CD8+淋巴細胞的數量顯著降低。 這種變化可能與EGFR-TKI耐藥有關，并為免疫檢查點抑制劑等后續治療提供線索。
因此，本研究旨在通過生物信息學分析來探索是否存在與第一代和第二代EGFR-TKI耐藥、免疫細胞浸潤和SCLC轉化相關的差異表達基因(DEGs)。并且為克服對EGFR-TKI的耐藥性提供新的見解。研究工作流程如圖 1 所示。
圖1：研究流程圖。
結果
TKI抗性差異表達基因（DEGs）的鑒定
作者在三套GEO數據集中一共識別出107個EGFR-TKI抗性versus EGFR-TKI敏感性的DEGs（圖2A）。
圖2
DEGs的GO和KEGG通路富集分析
結果表明，DEGs主要富集于細胞粘附、細胞外基質組織、正向調控GTPase活性、負向調控細胞增殖和生物過程的細胞信號轉導。細胞成分在細胞外泌體、質膜、細胞外間隙、細胞外區域和質膜的整體成分中顯著富集(圖2B-a)。而DEGs的KEGG通路分析顯示，它們與細胞粘附分子、病灶粘附、PI3K-Akt信號通路、T細胞受體信號通路等相關(圖2B-b)。
DEGs的蛋白質互作網絡(PPI)
作者利用STRING數據庫構建DEGs的PPI網絡，并在Cytoscape中可視化。利用MCODE提取了四個關鍵模塊; 基因之間的相關性越大，圓圈越大，顏色越深(圖2C)。作者發現在厄洛替尼和吉非替尼耐藥譜中CD44和FYN的表達均降低，而在阿法替尼耐藥譜中升高。
Hub基因的表達與生存分析
接下來，作者分析了Hub基因在GEPIA上的表達水平。與正常組織相比，RAB25、ERBB2、SPP1、CDH1、ESRP1、ITGB4在肺腺癌組織中的表達水平顯著升高，ZEB1、FYN的表達水平顯著降低(圖3A)。與高表達的SPP1和ITGB4相比，低表達的SPP1和ITGB4在LUAD和LUSC患者中與更好的總生存相關。另一方面，與低表達相比，同時高表達的SPP1和ZEB1與LUAD和LUSC患者的總生存期較差相關(圖3B)。因此，作者認為SPP1對NSCLC的生存具有重要意義。
圖3
SPP1在泛癌組織中的表達及預后潛力
接下來，作者研究了SPP1在泛癌中的表達。SPP1在多種腫瘤組織中表達明顯高于其同源正常組織(圖4A)。根據組織芯片對SPP1蛋白的染色，SPP1主要位于細胞質中。HPA數據庫結果顯示，肺腺癌腫瘤細胞中染色為中度，正常肺組織細胞中是低染色(圖4B)。作者還比較了EGFR突變體、野生型肺腺癌和TCGA正常樣本中SPP1的表達。與其他兩種類型相比，EGFR突變型肺腺癌中SPP1的表達水平顯著升高(圖4C)。
圖4
根據SPP1的表達水平，作者將EGFR突變的肺腺癌患者分為四組：0-25 %組，25%-50%組，50%-75%組和75%-100%組 (圖5A)。其中，最低表達組的DSS最長。25%-50%組和50%-75%組的中位生存時間分別為3.8年和3.2年(圖5B)。3年ROC曲線的AUC為0.762(圖5C)。因此，SPP1的表達水平可能是EGFR突變型肺腺癌的預后因素。
圖5
EGFR突變/野生型和TKI耐藥群體的免疫景觀
作者通過TIMER數據庫進一步分析了與肺腺癌預后hub基因表達相關的免疫細胞浸潤程度。 發現SPP1的表達與巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤呈正相關（圖 6A）。 xCell 結果顯示，與野生型相比，具有 EGFR 突變的肺腺癌患者的 CD8+ T 細胞和 CD4+ Th2 的豐度較低（圖 6B）。與低表達相比，SPP1 高表達的肺腺癌患者的巨噬細胞 M1 和 CD4+ Th2 細胞較多，而 CD8+ T 細胞較少（圖 6C）。這些結果可能表明 SPP1 可以調節腫瘤免疫耐受和免疫逃逸。
圖6
免疫浸潤景觀如圖 7A 所示。在圖 7B 中，兩類免疫能力（抗腫瘤免疫和促腫瘤抑制）呈正相關（R=0.5438，P<0.001）。作者還發現效應記憶 CD4 T 細胞、NK T 細胞、MDSC（髓源性抑制細胞）和 Th2 T 細胞中度或高度相關（圖 7C）。作者在每種免疫細胞中分別比較了厄洛替尼敏感和耐藥樣本之間的差異。發現與敏感組相比，耐藥組中的 CD8+ T 細胞和自然殺傷細胞較少，而 CD4+ T 細胞則更多（圖7D）。
圖7
SPP1與免疫細胞在肺腺癌中的預后分析
作者根據相關免疫細胞富集或耗盡的肺腺癌亞組中SPP1的表達進行了預后分析(圖8A)。研究發現無論B細胞和巨噬細胞浸潤水平如何，SPP1高表達的LUAD患者預后明顯較差。提示SPP1可能是不同免疫浸潤LUAD的有效預后指標。
泛癌組織中SPP1與TMB/MSI的共表達
作者發現PD-L1 (CD274)與SPP1之間呈現正相關（圖8B）。此外，作者通過對SPP1表達和TMB/MSI的分析發現，SPP1不僅在LUAD中與TMB和MSI密切相關，還與其他腫瘤相關。在DLBC、THYM、SARC、ACC和PRAD中，SPP1的表達與高TMB相關(圖8C)。另一方面，在LUAD和LUSC中SPP1與MSI呈負相關。在結腸癌（COAD）、腎上腺皮質癌（ACC）、肉瘤（SARC）、直腸癌（READ）和睪丸癌（TGCT）中，SPP1與MSI呈高相關性(圖8D)。
SCLC轉化共表達RNA-miRNA網絡
由于SCLC轉化也是EGFR-TKI耐藥的原因之一。作者比較了SCLC和TKI耐藥的DEGs，發現有42個基因在兩種基因圖譜中共同表達。CD44、MUC1、ESRP1、SPP1和ZEB1均為SCLC和TKI耐藥的中心基因(圖8E)。作者還發現hsa-miR-495-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-181a- 5p和hsa-miR-125a-3p通過疾病miRNAs網絡與SCLC和NSCLC均相關。同時，5個hub基因被預測為這些miRNAs的靶基因(圖8F)。
圖8
甲基化預后風險模型的建立和評價
接下來，作者比較了正常與LUAD患者SPP1表達及DNA甲基化情況。與正常組織相比，LUAD中SPP1表達較高，啟動子甲基化水平較低(圖9A)。SPP1啟動子的高甲基化代表基因表達降低。Cox比例風險模型包括5個中心基因(CD44、MUC1、ESRP1、SPP1和ZEB1)的CpGs。單因素和多因素分析顯示，LUAD患者SPP1 CpG cg00088885和CD44 CpG cg20971158與OS顯著相關(圖9B和C)，作者發現，z-score較低的患者通常比z-score較高的患者有更好的預后(圖9D-a)。根據多因素比例風險回歸模型，將患者分為高危組和低危組，發現低危組生存獲益更好(圖9D-b)。
圖9
TKIs敏感性與SPP1相關
利用Cell Miner數據，作者獲得了60種不同人類癌細胞的SPP1表達水平。大多數癌細胞的Z值低于0，即SPP1高表達，對藥物具有耐藥性。研究發現當SPP1基因表達時，除肺癌之外，乳腺癌、膠質母細胞瘤、結腸癌、黑素瘤等其他類型的癌癥也對TKIs具有耐藥性。
SPP1在EGFR突變型肺腺癌及癌旁組織中的表達水平
最后，作者收集了13個LUAD組織和8個癌旁組織，檢測SPP1在EGFR突變LUAD中的表達。qRT-PCR分析顯示，與相鄰正常組織相比，EGFR-突變LUAD組織中SPP1表達明顯升高(P=0.0188)(圖9E)。
結論
綜上所述，EGFR-TKI耐藥是肺癌靶向治療的一個關鍵問題。該研究的結果表明，SPP1上調可能誘導對第1代和第2代EGFR-TKIs的耐藥性，并且SPP1可能被視為TKI治療的獨立預后生物標志物。此外，SPP1的高表達可能促進抗腫瘤免疫細胞浸潤，在這種情況下可以考慮ICIs治療。同時，SPP1和CD44的DNA甲基化可能是肺腺癌患者的獨立預后因素。此外，5個hub基因可能通過調控EGFR-TKI耐藥的腫瘤干細胞促進LUAD向SCLC的轉化。
參考文獻
1. Wang, Z., Zhang, L., Xu, W., Li, J., Liu, Y., Zeng, X., Zhong, M. and Zhu, Y. (2022) The Multi-Omics Analysis of Key Genes Regulating EGFR-TKI Resistance, Immune Infiltration, SCLC Transformation in EGFR-Mutant NSCLC. J Inflamm Res, 15, 649-667.
