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不容錯過的5+鐵死亡生信分析思路
作為一種新的細胞死亡方式，鐵死亡的發現為許多疾病的認識和治療提供了新的思路。今天小編和大家分享一篇今年7月份發表于《Frontiers in Pharmacology》（IF：5.988）雜志上的關于鐵死亡的生信分析文章。該文章主要以基于鐵死亡的胃癌患者分型和預后為主線，并在此基礎之上結合突變、拷貝數變異、DNA甲基化、免疫相關特征、藥物反應等多個維度綜合地反映鐵死亡在胃癌中的功能重要性及其廣泛的臨床應用。
綜合分析胃癌中鐵死亡的變異和功能重要性
一、研究背景
鐵死亡（Ferroptosis）被描述為一種受脂質過氧化調節的鐵依賴性壞死。最近，一些研究提出了鐵死亡在胃癌（GC）中調節腫瘤發展和耐藥性的關鍵作用，其中刺激癌癥鐵死亡是一種很有前景的胃癌治療策略。然而，鐵死亡在胃癌中的詳細特征仍然不為人所知。在此，該研究系統地分析了鐵死亡的調控子以及刻畫了基于鐵死亡的治療策略在胃癌中的潛能。
二、結果
1、胃癌中鐵死亡調控子的表達、遺傳突變和DNA甲基化藍圖
作者收集了60個鐵死亡調控子（圖1A），發現相比于正常組織，大多數的鐵死亡調控子普遍在胃癌中表達上調（圖1B）以及發生拷貝數擴增（圖1D）。并且拷貝數擴增與胃癌中鐵死亡調控子的表達正相關（圖1E），而表觀遺傳修飾DNA甲基化與鐵死亡調控子表達呈負相關（圖1F）。綜上，結果表明拷貝數擴增與低甲基化可能導致了鐵死亡調控子在胃癌中的過表達。作者進一步發現鐵死亡調控子的表達在胃癌的分子亞型（EBV、MSI、GS、CIN）以及甲基化亞型（CIMP-High、CIMP-Low、CIMP-EBV、non-CIMP）呈現出廣泛的異質性，其中鐵死亡調控子在MSI以及CIMP-Low亞型中普遍高表達（圖1G-I）。此外，鐵死亡調控子HMOX1在EBV與CIMP-EBV亞型中具有較高的表達水平（圖1j-L）。
圖1、胃癌中鐵死亡調控子的表達、遺傳突變和DNA甲基化藍圖
2、胃癌中鐵死亡調控子的生物學功能、預后價值和免疫細胞浸潤相關性
KEGG通路富集分析結果顯示鐵死亡調控子主要富集了花生四烯酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、鐵死亡和谷胱甘肽代謝相關通路（圖2A）。GO功能富集分析結果發現這些基因參與脂肪酸衍生物代謝過程、谷胱甘肽代謝過程、氧化應激反應和硫化合物代謝過程（圖2B-D）。隨后，作者收集并整合了五套胃癌的數據集（圖2E，F），在整合數據集中發現15個鐵死亡調控子與胃癌預后顯著相關（圖2G）。基于額外的胃癌藥物敏感數據，發現鐵死亡調控子與多種藥物敏感性顯著相關（圖2H）。此外，鐵死亡調控子顯示出與免疫浸潤的明顯關聯，表明了胃癌中鐵死亡與腫瘤免疫之間的相互作用，例如HMOX1高表達與腫瘤浸潤免疫細胞浸潤水平升高相關（圖J）。
圖2、胃癌中鐵死亡調控子的生物學功能、預后價值和免疫細胞浸潤相關性
3、建立3個鐵死亡調控子介導的亞型，其具有不同的預后與免疫浸潤
基于上述整合數據中鐵死亡調控子的表達，一致性聚類識別到3個亞型（亞型A-C）（圖3A-D），并且亞型間鐵死亡調控子的表達差異被t-SNE結果所證實（圖3E）。其中亞型B具有最差的生存結果，而亞型C具有顯著的生存優勢。亞型B中大多數的鐵死亡調控子都明顯表達下調（圖3G），并且hallmarker通路活性結果顯示一些KRAS信號、乏氧、Notch信號以及hedgehog信號等致癌通路在亞型B中顯著激活，指示了其較差的預后（圖3H）。免疫浸潤分析結果顯示亞型B具有較高的先天免疫細胞浸潤（如NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、髓系抑制性細胞以及漿細胞樣樹突狀細胞）以及適應性免疫細胞浸潤（如效應記憶CD4+ T細胞、激活B細胞、激活CD8+ T細胞、效應記憶CD8+ T細胞、中央記憶CD8+ T細胞以及中央記憶CD4+ T細胞）（圖3IJ）。
圖3、建立3個鐵死亡調控子介導的亞型，其具有不同的預后與免疫浸潤
4、識別3個鐵死亡基因組亞型，其具有不同的預后與腫瘤微環境特征
作者進一步識別了上述鐵死亡亞型間74個共享的差異表達基因（圖4A，B），這些基因主要參與了上皮細胞調控與上皮細胞增殖等基質激活相關過程以及細胞因子分泌等免疫相關過程（圖4C）。基于上述共享差異表達基因，無監督聚類將樣本重新劃分為3類（鐵死亡基因組亞型A-C）（圖4D-G），其中基因組亞型C具有最差的預后，而基因組亞型A具有最好的生存優勢（圖4H）。深入分析發現基因組亞型C具有較高的先天免疫細胞浸潤（如NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、髓系抑制性細胞以及漿細胞樣樹突狀細胞）（圖4I），并且高表達免疫監測點基因BTLA, CD200, CD200R1,CD28, CD40LG, CD44, CD48,LAIR1, NRP1, PDCD1LG2,TNFRSF14, TNFRSF18與 TNFRSF8（圖J）。
圖4、識別3個鐵死亡基因組亞型，其具有不同的預后與腫瘤微環境特征
5、鐵死亡指數得分的建立及其相關臨床特征的評估
基于單變量Cox回歸分析，作者識別到22個與胃癌預后相關的共享差異表達基因（表1），進而基于其表達水平采用主成分分析方法開發了FPI（Ferroptosis Index）得分來量化鐵死亡亞型，發現高PFI得分指示較差的預后（圖5A）。PFI的臨床特征關聯分析發現年齡不滿65歲（vs ≥65）、癌癥等級G3（vs others）與癌癥分期II-IV（vs I）的患者群體具有更高的PFI得分，而不同性別間PFI不存在差異。這些結果指示PFI可能預測胃癌的惡性程度。此外，胃癌的分子亞型GS（vs EBV、MSI與CIN）、微衛星不穩定狀態MSS（vs MSI與MSL）以及DNA甲基化亞型non-CIMP（vs CIMP-High、CIMP-Low、CIMP-EBV）具有最高的PFI得分（圖5G-H）。
表1、胃癌預后相關的共享差異表達基因
圖5、鐵死亡指數得分的建立及其相關臨床特征的評估
6、鐵死亡指數得分與腫瘤免疫的關聯
進一步分析發現高PFI得分的患者具有較高的先天免疫細胞浸潤（如NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、髓系抑制性細胞以及漿細胞樣樹突狀細胞）、適應性免疫細胞浸潤（如效應記憶CD4+ T細胞、激活B細胞、激活CD8+ T細胞、效應記憶CD8+ T細胞、中央記憶CD8+ T細胞以及中央記憶CD4+ T細胞）以及免疫監測點表達（如CD40LG, CD40, BTLA,CD200R1,TNFSF14, CD27, LAIR1, CD28, HAVCR2, CD86,PDCD1LG2, TNFSF4, CD48, CD44, CD200與NRP1）（圖6A，B）。FPI得分與pan-F-TBRS、血管生成、上皮間質轉化等基質激活通路呈正相關，而與DNA損傷修復、DNA復制、核苷酸切除修復、同源重組和錯配修復以及致癌途徑如p53信號通路、癌癥錯配、病毒致癌等呈負相關（圖6C）。
圖6、鐵死亡指數得分與腫瘤免疫的關聯
7、鐵死亡指數得分預測免疫反應
作者首先在4套額外的數據集中驗證了高PFI得分指示更差的生存結果（圖7A-D）。而對于免疫治療，作者發現FPI得分高的患者卻更可能對抗CTLA-4治療產生治療響應。另外，在兩個anti-PD-1治療隊列中都發現高PFI得分指示更好的生存（圖7G，I），而且高PFI得分患者相比于低PFI得分患者具有更高的治療響應率 (圖7H，J)。
圖7、鐵死亡指數得分預測免疫反應
8、基于鐵死亡指數得分預測胃癌潛在的治療藥物
作者進一步評估了化療藥物多西他賽和順鉑的藥物反應。結果表明高PFI得分樣本具有顯著下降的多西他賽和順鉑的IC50值（圖8A，B），表明高PFI指示更高的多西他賽和順鉑的藥物敏感性。此外，作者基于PFI得分與化合物藥物敏感性間的相關性預測了胃癌的潛在藥物，包括6個CTRP衍生的化合物（圖C）以及13個PRISM衍生的化合物（圖E），并且FPI得分高的患者更有可能從上述化合物中獲益（圖8D，F）。
圖8、基于鐵死亡指數得分預測胃癌潛在的治療藥物
總結：
作者首先以鐵死亡調控子為切入點，刻畫了鐵死亡在胃癌中的基因組突變、拷貝數變異以及DNA甲基化藍圖，隨后重點基于鐵死亡識別的亞型與患者預后開發了PFI得分來定量化鐵死亡亞型，PFI得分與患者生存結果、hallmarker通路、腫瘤微環境、化療耐受以及免疫反應相關，并且可以預測胃癌潛在的治療藥物。該文章主要從鐵死亡亞型及其預后指示效能兩種主要維度，從多組學，多維度以及多層面的角度刻畫了鐵死亡在胃癌中的關鍵作用，非常值得借鑒。
