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大家好，今天給各位分享的文獻是2022年8月份發表在Nature cancer（IF=23.17）的文章。橫紋肌肉瘤中細胞發育層次和起源目前還不是特別清楚，本文利用單細胞測序技術分析了其發育情況，并發現了一群增殖細胞亞群，其特征與雙潛能肌肉間充質祖細胞有很大相似性。
Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma
單細胞分析和功能表征揭示了橫紋肌肉瘤的干細胞層次和發育起源
摘要：橫紋肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）是一種常見的兒童癌癥，其特征與發育中的骨骼肌相同。然而，與人類肌肉發育細胞層次守恒和腫瘤增殖細胞的關系還沒有報道。利用單細胞RNA測序、DNA條碼細胞命運圖譜和功能干細胞分析，作者揭示了RMS和人類肌肉發育中共享的腫瘤細胞層次。作者還確定了腫瘤細胞被捕獲的常見發育階段。在7-7.75周齡從胚胎發育到胎兒發育的肌肉細胞中發現，融合陰性的RMS細胞（Fusion-negative RMS，FN-RMS）類似于在胚胎和胎兒發育中發現的早期肌原細胞，而融合陽性的RMS（Fusion-positive RMS，FP-RMS）細胞表達了一個高度特異性的基因程序。融合陽性的RMS細胞也有神經通路富集狀態，表明肌肉譜系分層沒有那么嚴格。最后，作者在融合陰性RMS中發現了一個腫瘤增殖亞群，該亞群與既能制造肌肉細胞又能制造成骨細胞的雙潛能肌肉間充質祖細胞有顯著的相似性。
研究背景：許多癌癥含有分化程度較低的細胞類型，這些細胞具有自我更新和增殖能力，從而推動腫瘤生長。這些腫瘤增殖細胞（tumor-propagating cells，TPCs）可以分化產生腫瘤內所有細胞類型。TPCs已在急性髓系白血病、乳腺癌和結直腸癌等疾病中被發現。然而，一些癌癥沒有分級組織，并表現出促進腫瘤生長的極端細胞可塑性，最顯著例子就是黑色素瘤。除了確定TPCs在特定惡性腫瘤中驅動腫瘤生長外，目前還不太清楚在預測的起源組織中發現的相同自我更新程序和細胞命運決定是否在癌癥中重演。已有發現表明，一部分腫瘤重復利用了在它們原始組織中發現的相同發育干細胞通路，而其他腫瘤則采用新的自我更新程序作為其轉化過程的一部分。RMS是兒童最常見的軟組織肉瘤，與具有分級組織的骨骼肌存在相同組織病理學特征，使其成為解決這些問題的理想模型。RMS由兩種主要亞型組成，包括與FOXO1發生PAX3或PAX7易位的FP-RMS，以及FN-RMS在很大程度上被RAS通路激活轉化。雖然常見臨床特征決定了治療方式，但很明顯，外加的分子異質性是腫瘤侵襲性和耐藥性的基礎。事實上，外加的包括P53通路失活在內的遺傳擾動是FN-和FP-RMS中發生侵襲性和耐藥性的危險因素。盡管基因突變和分子異質性在驅動RMS侵襲性中發揮作用，但兩種RMS亞型都表達肌系轉錄因子，包括MYOD（Myoblast Determination Protein 1，成肌細胞決定蛋白1）、MYF5（Myogenic Factor 5，肌源性因子5）和/或成肌素，并且在整個胎兒、胚胎和成人發育過程中發現形態類似未分化的單核肌細胞，包括生皮肌節、衛星細胞、肌肉祖細胞和成肌細胞/肌細胞。這些數據表明，潛在的肌肉發育途徑可能驅動多種RMS腫瘤生長和維持。到目前為止，RMS分子細胞狀態與正常人類骨骼肌發育的直接關系還未被報道。也不知道RMS細胞層次在多大程度上再現肌肉中發現的細胞層次，以及腫瘤細胞在人類發育中停滯的成熟階段。關于RMS的爭議源于多種可能的細胞來源，以及缺乏對人類RMS腫瘤細胞異質性（包括維持腫瘤細胞生長的細胞類型）的詳細分子描述，這引導作者對人類RMS進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），并與人類肌肉發育進行比較。作者還進行了功能性干細胞分析，以確定FN-RMS中存在很大部分靜止的TPC，該TPC在應激后驅動癌癥再生。這種FN-RMS TPC與最近描述的制造肌肉和成骨細胞系的雙潛能間充質干細胞有顯著的相似性。
結果：
1.scRNA-seq顯示RMS異質性。
為了研究RMS中細胞狀態和肌肉發育層次的守恒，作者對患者來源的異種移植進行了基于10X的scRNA-seq，細胞聚類分析（圖1a）。相似基因表達的細胞簇被合并，使用分子特征數據庫確定細胞狀態（圖1b，c）。從分析中，作者發現常見的泛癌細胞狀態，包括增殖、缺氧、凋亡、干擾素和內質網應激反應細胞特征（圖1d）。作者還發現了RSM特異性細胞狀態，包括：（1）分化的肌細胞群表達MYLPF（Myosin Light chain 2，肌球蛋白輕鏈2），ACTC1（Actin Alpha Cardiac Muscle1，肌動蛋白α心肌1），LRRN1（Leucin Rich Repeat Neuronal 1），TNNT3（Troponin T3，肌鈣蛋白T3）和TSPAN33（Tetraspanin-33）；（2）表達細胞外基質和間充質基因包括MMP2（Matrix Metalloproteinase 2，基質金屬蛋白酶2）、CD44、PTN（Pleiotrophin，多效生長因子）、POSTN（Periostin，骨膜蛋白）和THY1（CD90）；（3）只在FP-RMS中發現富集神經通路的細胞類型。用FN-MAST85 PDX異種移植的兩只小鼠分別進行單細胞測序分析發現移植動物細胞狀態基本相似，從另外4個原發性患者樣本單核測序中也觀察到類似細胞狀態組成（圖1d）。RMS腫瘤間異質性分析顯示絕大多數腫瘤含有分化肌肉細胞（圖1d）。通過單細胞測序和IHC評估，一份FN-RMS模型（PDX MAST39及其轉移病灶MAST85）和一份FN-原發患者樣本（29806）不包含分化的肌肉細胞，這與缺乏分化肌肉細胞類型的RMS亞群的臨床表現一致。所有5種FN-RMS腫瘤均含有間充質富集細胞，而5種FP-RMS中只有2種含有這種細胞亞群（圖1d）。最后，大多數FP-RMS含有豐富神經通路細胞，這表明FP-RMS腫瘤可能通常采用這些細胞狀態作為轉化過程的一部分（圖1d）。最后，所有患者來源的RMS腫瘤都含有大量不表達上述任何轉錄基因的細胞，并被指定為“基態”（圖1c，d）。這些數據表明，存在四種RMS腫瘤細胞狀態，包括增殖細胞、基態細胞、間充質細胞和分化肌肉細胞。
圖1 scRNA-seq揭示了人RMS不同細胞狀態和腫瘤間異質性。a，實驗設計原理圖。b，從分子特征庫中查詢的RMS細胞狀態特征。c，熱圖顯示FN-MAST111 PDX的單個細胞和特定轉錄基因富集。d，單個腫瘤細胞狀態。
2．并不是所有RMS細胞都能啟動腫瘤生長。
為了測定FN-和FP-RMS PDX模型中腫瘤生長的潛伏期，作者將來自9個PDXs的RMS細胞移植到NSG小鼠中（圖2a-c）。為了研究單個RMS細胞是否能重制腫瘤并產生所有后續細胞狀態，作者將來自4個PDXs的單個腫瘤細胞植入NSG小鼠側腹（圖2a，d）。4個PDXs中有三個能形成腫瘤，包括兩個FN-和一個FP-RMS。scRNA-seq證實，植入單個RMS細胞產生的每個腫瘤都具有相似細胞狀態組成。這些結果證實單個腫瘤細胞可以重新填充整個RMS細胞狀態，包括FP-RMS中富集神經通路的細胞狀態，也表明一些RMSs包含大量TPCs。
圖2 單個RMS細胞可以重塑腫瘤內所有腫瘤細胞的異質性。a，實驗設計原理圖。b，PDX模型中具有代表性的腫瘤生長。c，在兩種稀釋條件下FN-和FP-RMS之間潛伏期差異。d，與單個RMS細胞移植產生的腫瘤相比，親本腫瘤的UMAP圖和腫瘤細胞狀態。
3.FN-RMS細胞含有分子定義的TPC。
為了評估FN-RMS細胞譜系和命運，使用人類FN-RMS RD細胞的LARRY條形碼完成scRNA-seq（圖3）。重要的是，RD細胞在二維培養和異種移植中都包含相同的四種優勢腫瘤細胞狀態（圖3b）。RD細胞在0.3感染倍數下被慢病毒感染，確保每個細胞集成一個唯一的條形碼副本（圖3a）。生信分析證實，在LARRY條形碼文庫中發現的大部分細胞在短期培養后仍保持細胞狀態（圖3c）。即在實驗條件下，親本細胞和子細胞中共有≥446個條形碼（圖3d），允許譜系追蹤和細胞命運可隨時間推移（圖3e-g）。正如預期，親代細胞主要由增殖細胞組成，并在高血清條件下驅動大量腫瘤生長（圖3f）。
為了直接研究間充質富集的RMS細胞狀態在促進癌癥生長中的作用，作者從功能上將腫瘤傳播潛能分配給離散群體的FN-RMS細胞。從scRNA-seq中分離出富集FN-RMS的間葉樣和分化肌肉亞群，包括兩個PDXs（MAST139、MSK7471）和三個RMS細胞系（RD、381T和SMS-CTR）（圖4）。使用CD44/CD90或CD90/CHODL抗體組合的流式技術分離RMS細胞，通過定量PCR評估，RMS細胞高度富集間充質細胞狀態。三維培養后，在所有五種FN-RMS模型中，尤其是與富含肌肉分化的細胞相比，間充質樣細胞產生更多（圖4d）且體積更大的腫瘤球（圖4e），與反選擇的陰性細胞類型或分化肌肉細胞相比，TPCs明顯富集（圖4f）。
該研究結果隨后用小鼠異種移植模型驗證。將FACS分選的細胞以極限稀釋分析（Extreme Limiting Dilution Analysis，ELDA）方式移植到NSG小鼠體內。間充質富集TPCs在FN-MAST139和FN-MSK74711中都能高效重建腫瘤，尤其是與分化肌肉相比（圖5a-c）。移植了富含間葉細胞的TPCs小鼠也表現出更快腫瘤再生時間，患病動物總數也有所增加（圖5b）。與反選擇細胞或肌細胞分化狀態的細胞相比，ELDA證實了間充質富集的分選細胞中TPC富集（圖5c）。間充質富集細胞移植產生的腫瘤也具有與大量移植腫瘤相似的組織學和異質性細胞群總數。相比之下，少數由CD44-/CD90-或CD90-/CHODL-細胞產生的腫瘤，根據流式分析和對MF20和TNNT3的免疫組化，間充質富集細胞狀態的重建明顯較低，分化細胞數量增加。最后，由間充質富集TPCs產生的移植瘤與親本腫瘤具有相似增殖率，而由間充質陰性細胞產生的移植瘤增殖率明顯低于親本腫瘤（圖5e）。這些數據表明，FN-RMS腫瘤含有一種獨特的、分子水平上定義的間充質途徑富集的TPC，在正常生長條件下大部分是靜止的，但當在培養和異種移植小鼠中生長時，它有可能重新進入細胞周期，分裂并產生與親本腫瘤相同的潛在異質性的腫瘤。
圖3 對人FN-RMS RD細胞的LARRY條形碼顯示，間充質富集細胞亞組分能夠在低血清、應激條件下促進腫瘤生長。a，實驗設計原理圖。b，LARRY條形碼庫中細胞狀態。c，對文庫中具有相同LARRY條形碼的RMS細胞進行定量，并與scRNA-seq基因表達分配的細胞狀態比較。d，顯示LARRY庫中發現的共享條形碼以及在不同條件下生長后的共享條形碼Veen圖。e，UMAP圖和在不同條件下生長的細胞狀態的定量。f，分析親本細胞對腫瘤整體生長的影響，以及高血清（上）、低血清（中）和低血清再調成高血清（下）后的下一代子細胞。g，在不同生長條件下細胞譜系和命運決定。
圖4 在FN-RMS間充質富集細胞中發現了腫瘤增殖潛能。a，實驗設計原理圖。b-e，FN-MAST139細胞亞群富集腫瘤增殖潛能分析。b，流式細胞術分析直接從生長在NSG小鼠體內的PDX腫瘤中收集的FN-MAST139細胞（左）和（右）。c，qPCR證實FACS后細胞狀態富集情況。d，PDX MAST139腫瘤球的形成。e，MAST139腫瘤球圖像（左）和大小量化（右）。f，杠鈴圖顯示了通過限制稀釋腫瘤球法測定的MAST139（139）、MSK74711（74711）、RD、381T和SMS-CTR（CTR）的TPCs百分比差異。
圖5 限制性稀釋細胞移植證實了FN-RMS間充質富集亞組分在體內具有腫瘤傳播潛能。a，CD44+/CD90+間充質富集細胞或CD44-/CD90-MAST139 PDX RMS細胞移植NSG小鼠的圖像。b，移植到NSG小鼠后腫瘤再生的潛伏期。c，杠鈴圖顯示FN-MAST139和FN-MSK74711極限稀釋細胞移植所確定的TPCs百分比差異。d，對分選細胞群生成的腫瘤進行流式分析。e，RMS分選細胞亞群移植腫瘤的組織病理學分析。
4.RMS與胚胎/胎兒肌肉在分子上有相似之處。
Davicioni等人先前在人RMS中發現了亞型特異性的轉錄基因程序，這使作者假設亞型特異性轉錄程序可能與人類肌肉發育的特定階段阻滯有關。然后將該基因列表與Davicioni等人之前定義的亞型特異性基因進行比較，生成FN-RMS或FP-RMS的高度特異性核心基因圖譜（圖6a）。正如預期，每個核心基因在所有腫瘤細胞中普遍表達，并且對FN-或FP-RMS具有高度特異性（圖6b）。此外，FP-RMS核心基因對Gryder等人定義的PAX3調控基因顯著富集，且還包含更大比例的PAX3不調控基因（圖6c）。接下來作者使用LISA（Landscape In Silico deletion Analysis，LISA）算法來預測每個核心差異表達基因的轉錄調控因子。LISA利用大量注釋的組蛋白標記染色質免疫沉淀測序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）和染色質可及性（Chromatin accessibility profiles）數據集，以構建查詢到的基因列表調控相關染色質模型。LISA分析顯示，PAX3位點在FP-RMS核心基因中富集程度較高（圖6c，右圖）。相反，FN-RMS核心基因不具有高富集預測PAX3調控基因。為了測試這些亞型特異性核心基因是否也在肌肉發育的特定階段富集，作者下一步將FP-和FN-RMS核心基因映射到通過scRNA-seq鑒定的人類胚胎、胎兒和成人肌肉細胞群（圖6d，e）。FN-RMS核心基因在胚胎和胎兒發育分離出的肌肉細胞中表達，但未在成年肌肉中表達（圖6e）。這些發現支持了一種觀點，即RMS兩種亞型都在胚胎或胎兒肌肉中發現的基因程序中表達，并揭示了FP-RMS細胞表達的轉錄程序與肌源性細胞從胚胎向胎兒肌肉發育過渡的一個嚴格控制的發育階段相關。
圖6 RMS亞型具有共同基因表達模式，并在胎兒和胚胎肌肉發育的不同階段被阻止。a，亞型特異性的核心基因通過scRNA-seq數據獲得。b，在FP-（左，MAST95）和FN-（右，MAST39）RMS中，不同細胞狀態下具有代表性的亞型特異性基因表達點圖。c，比較FP-和FN-RMS核心基因與Berkeley等人鑒定的PAX3結合基因的Veen圖（左）。LISA分析顯示了調節FP-或FN-RMS核心基因的最高預測轉錄因子結合位點（右）。d，胚胎、胎兒和成人骨骼肌scRNA-seq圖。e，組合亞型特異性核心基因（左）和代表基因（右）在正常肌肉發育中的表達情況。
5.RMS細胞與胚胎/胎兒肌肉共享干細胞層次
為了研究不同RMS細胞狀態是否與人類胚胎和胎兒發育中發現的相似，作者評估了RMS和正常人類肌肉之間的基因表達模式。作者富集了來自胚胎、胎兒和成人發育中的人類肌肉祖細胞、肌細胞/成肌細胞和骨骼肌間充質干細胞/祖細胞的scRNA-seq中RMS轉錄基因（圖7a）。RMS增殖基因在6-7周齡胚胎骨骼組織的人類肌肉祖細胞中富集（圖7b），反映了與細胞周期和這些細胞在發育過程中快速擴張相關的共享肌肉特異性轉錄程序。相比之下，分化的RMS肌肉轉錄基因在6-7周、9周和12-14周齡的肌細胞/成肌細胞中富集（圖7a，b）。值得注意的是，間充質富集的TPC信號在SkM Mesen干細胞中優先表達。胚胎發育9周和12-14周間質細富集分數為負（圖7a，b）。如正常SkM Mesen干細胞一樣，這些間質富集的TPCs也獨特表達成骨基因OGN（Osteoglycin，骨球蛋白）和MGP（Matrix Gla protein）（圖7c）。作者通過qPCR和抗體共染色驗證了OGN和MGP在FACS分離的間充質強化RMS細胞中高表達（圖7d）。這些數據驗證了RMS TPCs與SkM Mesen干細胞的顯著相似性。接下來，作者從功能上評估了FN-RMS間充質富集TPCs生成成骨細胞的能力，如果這些細胞與雙效SkM在轉錄和功能上有相似性，就可以預測這些細胞類型。從FN-MAST139、RD和381T細胞中分離出FACS分選的間充質細胞、分化的肌肉細胞或反選擇細胞，在成骨分化培養基中培養18天（圖7e，f）。來自所有三種模型的間充質富集TPC產生了更多茜素紅S+成骨細胞系，而反選擇和分化的肌肉細胞不能有效地產生成骨細胞（圖7e，f）。這些數據支持FN-RMS TPCs和最近定義的雙潛能SKM Mesen干細胞之間共享干細胞狀態和功能。
圖7 間充質富集的FN-RMS TPCs在轉錄和功能上與雙效SkM.Mesen有相似之處。a，人類肌肉細胞scRNA-seq圖譜。b，GSEA評估正常肌細胞亞群中RMS細胞狀態表達。c，細胞狀態（左）和標記間充質富集RMS細胞的骨球蛋白（OGN）、基質Gla蛋白（MGP）和CD90的基因表達（右）。d，qPCR驗證來自PDX MAST139和MSK74711的FACS分離的間充質富集RMS細胞中的OGN和MGP。e，使用MAST139細胞的成骨分化實驗。在成骨分化培養基中生長18天后，用茜素紅S染色的MAST139圖像（左）和量化（右）。f，FACS分離的RD和381T細胞在成骨分化培養基中培養后茜素紅S染色的定量。
結論：總之，該研究工作揭示了人類肌肉發育和RMS之間潛在的細胞層次結構的顯著守恒。作者還在FN-RMS中發現了一個分子水平定義的、基本為靜止的TPC，該TPC在分子、發育和功能上與新描述的雙潛能肌間充質干細胞/祖細胞有相似之處。
參考文獻：Wei Y, Qin Q, Yan C, et al. Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma[J]. Nat Cancer. 2022,3(8):961-975.
