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經典生信思路：構建腫瘤代謝相關風險預測模型
導讀
前段時間我們公眾號推了一篇與腫瘤代謝和腫瘤免疫相關的文章，在那篇文章的思路擴展中就提到了用生信的角度解讀腫瘤代謝和腫瘤免疫。今天和大家一起學習一篇發表在《Frontiers in Immunology》的一篇文章，在這篇文章中，作者構建一個與代謝相關的基因圖譜來預測前列腺癌(PCa)的復發和治療反應。因為PCa是男性最常見的惡性腫瘤。雖然近幾十年來PCa的臨床治療取得了很大進展，但是，一旦其對治療產生耐受性，PCa會在復發后會迅速發展。并且PCa從早期腫瘤轉變為晚期腫瘤的過程中一直表現出一種獨特的代謝重編程。然而，對于PCa代謝格局的改變與腫瘤復發和治療反應的關系缺乏系統和全面的研究。
結果解讀：
為了在基因水平上系統和全面地研究PCa的代謝情況，作者先從TCGA PCa數據集中篩選出了代謝相關的差異表達基因 (mDEGs)（圖1A）。接下來作者使用GO分析和KEGG分析來研究這些基因的功能。GO分析顯示mDEGs與脂肪代謝、氨基酸代謝、激素代謝和羧酸生物合成等有關 (圖1B)。KEGG富集分析結果表明，mDEGs與藥物、花生四烯酸、酪氨酸和嘌呤代謝途徑顯著相關(圖1C)。為了研究代謝變化是否與PCa的復發和進展有關，作者根據mDEGs的表達情況，用一致性聚類法將腫瘤組織分為3組不同的亞組（圖1D，E）。三種代謝亞型的無病生存率(DFS)顯示出顯著差異（圖 1F）。總的來說，這些結果表明腫瘤代謝重編程在 PCa 復發和進展中起重要作用。
首先，作者通過STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡，以確定1186個mDEG的中樞基因。根據connection score，前100個中樞基因可能在PCa的進展中發揮更重要的作用（圖2A）。KEGG分析結果表明，關鍵的mDEGs富集到突觸通路、能量代謝通路(PI3K-AKT、MAPK和PARP)、藥物代謝通路、膽固醇代謝通路、內分泌抵抗和類固醇激素生物合成通路，這些通路與前列腺癌的發展有關。GO分析表明這些mDEGs與類固醇和激素代謝過程、內質網腔、GTPase復合物和代謝物條帶有關（圖2B、C），這表明關鍵 mDEGs 在代謝和 PCa 進展中具有重要作用。然后采用單因素COX回歸分析，篩選出與DFS相關的mDEGs。在前100個基因中，有25個基因與DFS顯著相關，其中10個基因與危險因素相關，15個基因顯示保護作用（圖2D）。如圖2E所示，大多數與生存相關的關鍵mDEGs相互關聯，這表明PCa的代謝重編程是一個整體的變化，而不是單個基因的變化。
為了構建一個全面有效的代謝相關風險模型(MRM)來預測患者的預后，作者對DFS相關的關鍵mDEGs進行了Lasso Cox回歸分析。交叉驗證后，5個基因(APOE、AHSG、BGN、SLC2A4和CYP2D6)最為突出(圖3A、B)。然后進行多因素COX回歸分析，進一步驗證獨立的預后相關基因，并獲得基因指數。如圖3C所示，APOE、AHSG、BGN和CYP2D6是獨立的危險因素，SLC2A4是獨立的保護因素。然后作者根據這個模型計算MRS（代謝相關危險評分），并根據MRS的中位數將492例PCa患者分為high-MRS亞組(n=246)和low-MRS亞組(n=246)(圖3D)。如圖3E，F所示，high-MRS亞組的DFS率明顯低于low-MRS亞組，表明high-MRS意味著更高的復發率。ROC曲線表明 MRM且具有良好的敏感性和特異性（圖3G）。此外，ROC曲線顯示MRM預測DFS的準確性優于其他臨床參數(Gleason評分、前列腺特異性抗原(PSA)水平、TNM分期和年齡)(圖3H)。此外，作者還探討了MRS、臨床特征和TCGA中PCa數據庫中關鍵mDEGs表達水平之間的關系。圖3I的熱圖顯示APOE、BGN、AHSG和CYP2D6在high-MRS亞組的表達增加，而SLC2A4則相反。MRS與Gleason評分、TNM分期呈正相關，與PSA水平無關。單因素COX回歸分析顯示Gleason評分、PSA水平、T分期和MRS與PCa的DFS密切相關(圖3J)，多因素COX回歸分析發現MRS的p值最低，提示MRS可能是PCa最重要的獨立預后指標(圖3K)。因此，與目前使用的預后因素相比，MRM可能是預測PCa患者DFS的更好的指標。
為了驗證模型的預后價值，經過篩選，作者選擇在Taylor 和ICGC兩個數據集驗證MRM的可靠性，與TCGA數據庫得出的結果類似，MRS越高的患者DFS時間或BCR時間越短，復發的可能性越大，預后也越差(圖4A)。Taylor PCa隊列中1、3和5年BCR的AUC值分別為0.75、0.73和0.69，ICGC PCA中的AUC值分別為0.82、0.85和0.80，表明MRM可能是預測PCa患者DFS的一個潛在臨床特征，具有較高的準確性和可靠性(圖4B)。此外，如圖4C所示，由Taylor和ICGC PCa隊列得出的ROC曲線表明，MRM的預測準確性最優。Taylor和ICGC隊列的結果與TCGA的結果一致。在Taylor中，單因素和多因素Cox回歸分析顯示Gleason評分、PAS水平、T分期和MRS均與DFS密切相關，可作為PCa的獨立預后指標(圖4D)。在ICGC PCa隊列中，單因素COX回歸分析顯示Gleason評分、T分期和MRS與DFS密切相關；多變量COX回歸分析發現只有T分期和MRS是PCa的獨立預后指標，但Gleason評分不是PCa的獨立預后指標(圖4e)，這可能與樣本量、數據源的異質性和構成有關。因此，這些數據表明，在兩個獨立的PCA隊列中，MRM是DFS或BCR的最佳獨立預測因子。
接下來，作者使用鄭州大學第一附屬醫院收集的組織來研究MRM在真是世界研究（RWS）的價值。如圖4F所示，與正常前列腺組織相比，APOE、AHSG、BGN和CYP2D6在前列腺癌組織中顯著上調，而SLC2A4則顯示出相反的結果。進一步分析發現，MRS和pMRS（蛋白質水平的MRS）與Gleason評分和T分期密切相關，pMRS與N分期和分級呈正相關(圖4G)。
首先，作者用GSEA來預測PCa TCGA隊列中high-MRS組和low-MRS組之間的基因集變化。結果顯示，high-MRS樣本的基因富集在與增殖和細胞周期有關的通路上，而low-MRS樣本富集到基因集則包含PCa下調和轉移腫瘤下調的基因 (圖5A)，這表明MRM亞組之間的腫瘤生長和轉移存在顯著差異。然后作者進行基因表達分析，通過比較high-和low-MRS組鑒定出1258個基因(圖5B)。進一步研究發現，DEGs主要存在于多種代謝過程、跨膜轉運體復合體和酶活性中(圖5C)。KEGG分析還表明，這些DEGs與代謝途徑密切相關，如PPAR信號通路、cAMP信號通路、類固醇激素生物合成、膽固醇代謝和藥物代謝(圖5D)。KEGG分析顯示出具有代表性的代謝途徑，特別是脂肪代謝和氨基酸代謝途徑（圖5E）。此外，GO和KEGG富集分析表明，DEGs還與突觸、細胞外基質和細胞因子有關，這表明MRM與神經內分泌轉化有關，并且不同亞群具有不同的微環境(圖5C，D)。
TME是腫瘤細胞周圍的微環境，包括免疫細胞、周圍血管、成纖維細胞、細胞外基質和各種信號分子。首先，作者探討了MRS和TME之間的關系。MRS與TME評分呈正相關，high-MRS組免疫細胞浸潤和間質評分高于低MRS組(圖6A)。high-MRS樣本的基因組富集到免疫反應相關的通路 (圖6B)。隨后，作者進一步研究了MRS與PCa免疫細胞浸潤的相關性，MRS相關的免疫環境的特征如圖6C所示。作者篩選和收集了經典的免疫檢查點，然后應用這些基因來定義不同MRS組之間的免疫和分子功能。結果發現，MRS與PDCD1、PDL1、CTLA4等30個免疫檢查點的表達密切相關（Figure 6D）。值得注意的是，CTLA4和PDCD1的表達在高MRS樣本中顯著升高(圖6E)，這表明免疫療法可能是這些患者相對有效的治療方法。另外，在預測免疫治療反應方面，MRM的AUC值是臨床特征中最高的(圖6E)，表明這一新特征MRM可能是預測PCa患者免疫治療反應的潛在指標。最后，作者進行了多重免疫熒光(mIF)檢測出免疫檢查點在PCa中的表達相對較弱，但high-MRS亞組的CTLA4和PDCD1表達均高于low-MRS亞組(圖6F)。正如預測的那樣，這些結果表明high-MRS亞組比low-MRS亞組更有可能從免疫治療中受益。
作者假設不同MRS亞組的患者對藥物的敏感性不同。作者通過KEGG富集分析發現內分泌治療耐藥、DNA修復基因、甲基化沉默和阿霉素耐藥相關的通路與high-MRS相關，而藥物反應相關的基因與低MRS呈正相關(圖7A)。隨后作者比較了高 MRS 組和低 MRS 組對常見抗癌藥物的敏感性，以指導不同 PCa 患者的治療選擇。在標準藥物選擇方面，低 MRS 亞組患者對抗雄激素（阿比特龍）更敏感，而高 MRS 組患者對化療（多西他賽和吉西他濱-順鉑（GC）化療）更敏感（圖 7B）。在推薦藥物選擇方面，低 MRS 亞組患者對 EGFR 抑制劑（如阿法替尼）、BI-2536（PLK1 和 BRD4）、HDAC 抑制劑（他西地那林）和 TGF-β 受體抑制劑（SB- 505124），而高 MRS 亞組的患者對 CDK 抑制劑（例如 AZD 5438）、PARP 抑制劑（例如 niraparib）和鐵死亡激動劑（RSL3，erastin）更敏感（圖 7C、D）
全文總結：
該文作者構建一個與代謝相關的基因圖譜，來預測PCa的復發和治療反應。并且作者還證明了它可以作為一種臨床特征，更準確地評估預后，指導PCa患者選擇合適的治療方法。該方法在臨床上也有進一步的應用前景。從思路上看，這篇文章是一篇經典的生信文章，而且在驗證時也加入“濕”實驗進行驗證。這進一步提高分析思路的創新性和說服力，值得我們學習。
參考文獻
1. Zhou L, Fan R, Luo Y, et al. A Metabolism-Related Gene Landscape Predicts Prostate Cancer Recurrence and Treatment Response. Front Immunol. 2022;13:837991.
