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今天小編給大家帶來一篇今年七月Briefings in Bioinformatics雜志新鮮出爐的文章：Immune infiltration and clinical significance analyses of the coagulation-related genes in hepatocellular carcinoma（IF=13.994）。本篇文章基于KEGG數據庫中收集的凝血途徑，在肝細胞癌患者中區分了兩種與凝血相關的亞型。并證明了兩種凝血相關亞型在免疫特征和預后分層方面的明顯差異。在TCGA隊列中建立了凝血相關風險評分預后模型，用于風險分層和預后預測。還建立了一個nomogram，以便于臨床使用該風險評分，并使用不同的方法驗證其有效性。
原發性肝癌(PLC)是第六大常見惡性腫瘤，其中肝細胞癌是最常見的類型之一。全世界每年確診的肝癌病例超過70萬例，其中一半來自中國。惡性腫瘤患者易發生一些并發癥，如靜脈血栓(VTE)，門靜脈血栓(PVT)都是肝細胞癌患者中最常見的并發癥。凝血可以導致出血和血管壁破裂，也可以通過增加血管通透性和血漿外滲，從而導致血管外凝血。許多肝病，如肝硬變、自身免疫性肝病和肝腫瘤，都存在凝血系統紊亂。而最近的相關報道顯示，凝血與腫瘤免疫微環境有關。
TME在肝細胞癌的發展中起著關鍵作用。腫瘤凝固體，一個由癌癥驅動的有利于血栓形成或出血的分子效應網絡，已經成為癌癥研究的熱點。凝固體可以與TME相互作用，甚至影響腫瘤免疫反應。凝血系統的激活有助于啟動炎癥反應，募集和激活多形核細胞和巨噬細胞。為了提高抗腫瘤免疫，抗凝劑可能是免疫檢查點阻滯劑(ICB)的有效輔助治療。直接口服抗凝劑(DOAC)利伐沙班可增強ICB對惡性黑色素瘤的療效。
作者首先對TCGA數據中355例肝細胞癌患者的SCNA和突變頻率進行可視化，約65.9%的患者發生CRG的DNA突變，CRG的DNA突變水平從2%到5%（圖1A,B）。雖然CRG中沒有觀察到很高的突變頻率，但SCNA是大多數DNA改變的原因。約66.57%的肝細胞癌患者至少有一個CRG的SCNA。大多數具有高CNA頻率的CRG傾向于共擴增而不是共缺失（圖1G）。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示，CNA頻率低的患者比CNA頻率高的患者有更長的OS和PFS。
根據TCGA中CRGs的表達水平，采用非監督聚類，確定了兩種不同的調控模式，包括凝血相關簇1中的200例患者和凝血相關簇2中的109例患者。對三個數據集(TCGA、ICGC和GSE14103)進行評估，簇1的生存優勢都高于簇2（圖2C）。簇1患者的組織學G1、Child1級、TNM分期I-II和存活結果的比例高于簇2，卡方檢驗結果顯示不同臨床特征之間的差異有統計學意義（圖2E）。也就是說CRGs可能通過一些潛在的機制影響腫瘤的發展。
GSVA發現這兩個亞型有著不同的免疫滲透模式。簇1顯著富含免疫和炎癥通路(包括T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、nod-like受體信號通路、toll-like受體信號通路)和肝癌干細胞信號調節通路(notch信號通路和wnt信號通路)（圖3A）。GSEA分析證實兩個簇在免疫途徑上存在差異。簇1中高表達的DEGs顯著富集在T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、Th1和Th2細胞分化以及Th17細胞分化。使用ImmuneCellAI，研究了兩個集群的TME。簇1中高表達CD8、CD8、CD4、CD8、CD8、NKT、Th1等細胞，而簇2中高表達樹突狀細胞、誘導調節性T細胞、自然調節性T細胞、Th17、單核細胞和中性粒細胞。基于TCGA表達譜的估計算法計算惡性腫瘤組織的間質評分、免疫評分和ESTIMATE評分。
簇1樣本的評估分數也顯著高于簇2，基質評分和免疫評分也顯著高于簇2。包括TMB評分、TEDGE評分和免疫檢查點分子表達在內的一系列評價指標代表了對免疫檢查點抑制劑的反應。經Wilcoxon檢驗，PD-1、PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3和TIGIT的表達水平簇1均顯著高于簇2，TMB評分也明顯高于簇2（圖4）。
圖5A圖由200個節點和6742條邊組成的CRG的PPI網絡。采用度和最大鄰域分量(MNC)兩種拓撲算法從復雜的PPI網絡中識別HUB基因。由兩種方法計算的前20個基因如圖5B所示。在這兩種算法中，這些基因的排序序列是相同的。因此，這20個CRG可以被視為凝血途徑的樞紐基因。借助GSE19151，包括深靜脈血栓形成樣本和正常樣本，進一步篩選出關鍵的CRG。LIMMA識別了VTE和正常樣本之間的總共740個度。來自GSE19151和前20個CRG的重疊DEG發現了三個關鍵的CRG(PRKACA、PIK3R1和ITGB2)（圖5D）。PRKACA和ITGB2在大多數癌癥的腫瘤樣本中上調，PIK3R1主要在LIHC、THCA和KIRP中上調。三個關鍵CRG在KIRC、KIRP、LIHC和THCA中均表現出擴增的表達模式。泛癌生存分析表明，關鍵的CRG在多種癌癥中起到保護作用（圖5F）。
對TCGA數據集進行單變量COX回歸。發現只有PIK3R1可作為肝癌的良好保護因子。PIK3R1與肝細胞癌中的OS顯著相關。最后進行多變量Cox回歸，變量包括PIK3R1、T期、N期和M期。發現PIK3R1可作為獨立的預后因素（圖6D）。結果再次表明，凝血途徑與肝癌患者的生存密切相關，即PIK3R1可能是一個對惡性腫瘤患者具有更好預測價值的保護因子。
使用TCGA數據中有OS信息肝細胞癌患者建立預后模型。采用LASSO Cox回歸分析從300個CRG中篩選出最佳預后信號。將變量引入Lasso Cox回歸模型，選取11個凝血相關指標，建立凝血相關風險評分(CRRS)模型。其中一些標志物如PLCB4、GP6、PIK3R1、GP1BA和PLA2G4F的表達水平似乎無統計學意義(P>0.05)，但可能與其他標志物和預后相關。SERPINA1、PLCB3、PIK3R6和PPP1CB的表達水平與預后顯著正相關，而GP6、P2RX1、PLA2G4F、PLCB4、GP1BA、PIK3R1和CFHR3的表達水平則相反（圖7 C,D）。與其他單因素COX回歸模型相比，組合模型具有最高的C指數。在三個不同的數據集(TCGA、ICGC和GSE14520)中，與其他單一信號相比，聯合模型的ROC曲線下面積(AUC)最大，這證明聯合模型的預測效率最高（圖7G）。對于生存分析，根據建立的計算公式計算每個患者的CRRS，包括微陣列數據(GSE14520、GSE76427和GSE10143)和測序數據(TCGA和ICGC)。根據中位風險評分，這些病例被分為高風險和低風險隊列。
比較5種免疫檢查點分子(PD1、PD-L1、CTLA4、LAG3和HAVCR2)在高低危險組的表達。三種免疫檢查點分子(PD-L1、CTLA4和LAG3)在高危人群中顯著上調（圖8A）。IPS、IPS-CTLA4、IPS-PD1和IPS-PD1-CTLA4評分在高危人群中較高（圖8B）。作者比較了TMB、TME評分和TEDER評分在不同風險組中的分布。發現高危人群的TMB和TME評分較高，TIDE評分則相反（圖8C,D,E）。目前，免疫治療發展的瓶頸之一是缺乏新的預測生物標志物。根據上述研究，凝血亞型與免疫微環境有顯著相關性，因此我們試圖研究CRRS能否預測肝細胞癌的免疫治療反應。
使用接受抗PD-L1治療的尿路上皮癌數據集(IMvigor210)和接受抗PD-1和抗CTLA4治療的惡性黑色素瘤數據集(GSE91016)作為測試集。根據IMvigor210、GSE91016和GSE140901的結果，不同凝血亞型之間的反應亞型(CR、PR、SD和PD)有顯著差異。CRRS值高的患者SD/PD比例較高，CRR值低的患者CR/PR比例較高。將三個數據中接受免疫治療的患者分為高CRRS亞型和低CRRS亞型。使用ROC分析來評估CRRS免疫治療益處的預測潛力。ROC曲線下的面積(AUC)在IMvigor210中為0.9013，在GSE140901中為0.9444，在GSE91061中為0.9016。這些結果表明，低風險組比高風險組對免疫治療的反應更好。這就解釋了為什么低CRRS的肝細胞癌患者的存活率高于高CRRS的患者。
在GSE104580中檢驗CRRS在接受TACE治療的肝癌患者中的預測價值。該數據包括TACE反應和TACE耐藥的肝細胞癌患者的mRNA表達陣列。通過比較GSE104580的CRRS，發現TACE有效組的CRRS高于TACE耐藥組（圖9A）。ROC曲線顯示CRRS對TACE耐藥有較高的診斷價值。此外，在GSE69164和GSE7750中闡明了風險評分和PVTT之間的關系（圖9 B,C）。有門靜脈血栓形成的肝癌患者的CRRS明顯高于無門靜脈血栓形成的肝癌患者，ROC曲線也證明CRRS能特異性地區分有無門靜脈血栓形成的肝癌患者。計算每例肝癌患者對6種常用化療藥物的IC50值。通過比較兩個風險組IC50值的差異，我們發現高CRRS亞組對除羅可維汀外的大多數藥物敏感（圖9D）。利用藥物基因相互作用數據庫(DGIdb)尋找對肝癌有治療作用的小分子藥物。在PubChem中發現了阿司匹林、Alpelisib、Copanlisib、Sonolisib、PF-04691502和Pilaralisib的三維結構斷層掃描（圖9E）。
通過單因素和多因素的COX回歸分析來確定CRRS是否是肝細胞癌患者臨床獨立的預后因素。將CRRS、年齡、性別、兒童分級、腫瘤類型和TNM分期作為協變量進行分析（圖10 A,B）。結果表明，年齡、分期和CRRS是可用于預測肝細胞癌患者預后的獨立因素。通過結合獨立的預后因素，作者構建了一個nomogram，作為臨床相關的量化方法，臨床醫生可以通過它來預測肝癌患者的死亡率（圖10C）。通過將每個預后參數的打分相加，每個患者將被分配一個總打分值。總分越高，患者越差。此外，多個隊列(TCGA、ICGC和GSE76427)的校準圖表明，nomogram的性能與理想模型的性能相似。基于TCGA數據的不同變量的隨時間變化的C指數曲線顯示，與其他單一因素相比，nomogram的表現最佳。三個數據隨時間變化的ROC也表明，nomogram具有很高的預測能力（圖10 D,E,F）。
在這篇文章的研究中，利用無監督聚類算法，基于TCGA數據識別與凝血相關的分子亞型。比較了兩種凝血亞型在富集注釋、TME和免疫治療反應方面的差異。然后，作者探索了凝血途徑中的關鍵基因，并驗證了它們對肝細胞癌患者預后的重要價值。基于LASSO Cox回歸模型篩選出的7個預后指標，從TCGA隊列中構建了肝癌患者凝血相關風險評分(CRRS)預后模型。在不同的平臺數據集上評價其對免疫檢查點抑制劑、經導管動脈化療栓塞術(TACE)和化療的生存概率和治療效果的預測能力。最后，結合風險評分和其他預后臨床指標，構建一個nomogram來量化生存概率。根據這些結果，可以得出結論，肝癌患者的凝血狀態與TME之間存在明顯的相關性，風險評分可以作為一個強有力的預后生物標志物，為化療和免疫治療提供治療益處，并可能有助于肝癌患者的臨床決策。
