掃碼聯系客服
今天給大家分享一篇發表在BMC MEDICINE（IF:11.15）上的文章:
DNA methylation subtypes guiding prognostic assessment and linking to responses the DNA methyltransferase inhibitor SGI-110 in urothelial carcinoma
鑒定尿路上皮癌中具有預后分層的DNA甲基化亞型
一．研究背景
尿路上皮癌（UC）是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，包括膀胱癌和上尿路上皮癌，膀胱癌（UCB）占UC的90-95%，而上尿路上皮癌（UTUC）并不常見，占UC的5-10%。雖然基因組研究表明UTUC和UCB之間的體細胞改變發生率存在顯著差異，但UTUC和UCB之間的表觀遺傳差異程度和臨床相關性仍是未知。越來越多的證據表明DNA甲基化與UCB腫瘤進展密切相關。最初，DNA超甲基化的研究集中于潛在候選基因的CpG島。獨特的DNA甲基化模式可以區分非肌層浸潤性和肌層浸潤性UCB，并與臨床預后相關。然而，UTUC中的DNA甲基化分析以及圖譜研究仍然很少見。UTUC和UCB之間差異DNA甲基化的比較分析也比較有限，研究通常集中在選定的癌癥相關基因上。已有文獻報道，對于一些基因，UTUC中的啟動子甲基化比UCB中的更常見和廣泛。然而，在之前的研究中，對腫瘤組織和尿沉渣樣本中UTUC和UCB的全基因組測序（WGS）和全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）數據進行比較后發現，兩種癌癥類型中都存在類似的基因組CNV和DNA甲基化改變。因此，對比兩者之間的DNA甲基化譜將有助于UC診斷、預測甚至治療的發展。
二．研究方法
在本研究中，研究者收集了上尿路上皮癌旁組織、上尿路上皮癌和膀胱癌組織共49例。通過整合全基因組甲基化和轉錄組數據研究了UTUC和UCB的表觀基因組特征和圖譜并發現上尿路上皮癌和膀胱癌的DNA甲基化圖譜非常相似。進一步通過對腫瘤的DNA甲基化模塊進行非負矩陣分解鑒定出兩種與預后相關的DNA甲基化亞型（Methy-High和Methy-Low），以探索腫瘤的潛在風險分層。此研究還發現，DNA甲基轉移酶抑制劑SGI-110通過上調多種抗腫瘤免疫通路抑制Methy-High 亞型膀胱癌細胞系的遷移和侵襲。
三．研究結果
1、UTUC和UCB的DNA甲基化譜比較
為了研究UTUC和UCB之間DNA甲基化圖譜的潛在差異，研究者使用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）檢測了原發性腫瘤組織的全基因組DNA甲基化譜，包括36個UTUC樣本和9個UCB樣本，以及4個相鄰正常組織。正如預期的那樣，當將兩種類型的腫瘤與相鄰的正常組織進行比較時，發現DNA甲基化水平在全基因組水平上降低，在啟動子區域和5′UTR區域增加（圖1A）。密度圖進一步顯示，與正常鄰近組織相比，UC腫瘤組織中的DNA甲基化整體水平降低（圖1B）。引人注目的是，UTUC和UCB中的DNA甲基化情況相似（圖1C、D）。如圖1E所示，對于一個具有代表性的基因組位點，chr1:32132880-53207909，UTUC和UCB中都證明了全局去甲基化，并且UTUC和UCB之間的DNA甲基化圖譜非常相似。
2. DNA甲基化亞型分類
接下來，該工作研究了UC中是否存在不同的DNA甲基化亞型。研究者使用甲基化單倍型(methylation haplotype block，MHB）分析方法在UC腫瘤組織和正常鄰近組織中鑒定了84345個組織特異性甲基化單倍型區塊（MHB）。采用了非負矩陣分解算法對UC樣本進行分類，使用具有最多可變甲基化單倍型負荷（MHL）的前20000個MHB（圖2A）。45例UC樣本分為兩個亞型：Methy-C1（n=19；42.2%）和Methy-C2（n=26；57.8%）（圖2B）。
3. UC甲基化亞型的臨床病理相關性
為了研究UC中DNA甲基化亞型的臨床相關性，對44名UC患者、TCGA隊列中的411名UCB患者和日本隊列中的86名UTUC患者進行了臨床病理學關聯分析。在發現隊列中，屬于Methy-High亞型的腫瘤患者的總生存期低于屬于Methy-Low亞型的腫瘤患者。同樣，屬于Methy-High亞型的腫瘤患者的無進展生存期也較短（圖2C）。此外，Methy-High亞型富集于更高的腫瘤分期(≥T3、12/25與2/19）和肌肉浸潤性腫瘤（19/25與6/19）（圖2D，E）。此外，對于日本隊列，同樣確定了兩種甲基化亞型（Methy-Low（n=52）和Methy-High（n=34）），并進一步證實甲基化高亞型具有較短的疾病特異性生存率和無進展生存率（圖2F）。由于研究者只確定了有限數量的UCB患者的WGSB圖譜，因此整合了TCGA（n=411）的人類甲基化450（EPIC）BeadChip陣列數據。使用類似的策略，定義了UCB患者的Methy-High和Methy-Low亞型。值得注意的是，與UCB組中的Methy-Low亞型患者相比，Methy-High亞型患者的總生存期更短，腫瘤分期更高（圖2G）。通過單變量Cox回歸分析發現，T分期、年齡、淋巴結轉移、遠端轉移和甲基化亞型與患者生存率顯著相關。進一步的多變量Cox回歸顯示，甲基化亞型是一個獨立的預后因素（圖2H）。
4. Methy-High 的UC患者以basal相關基因表達為主，免疫和基質評分較高
為了描述定義UC甲基化亞型的基因表達譜，對9個UTUC腫瘤進行了RNA-seq測序，包括4個Methy-High亞型和5個Methy-Low亞型，以及已發表的TCGA UCB隊列。首先，與Methy-Low亞型相比，在Methy-High亞型中識別出1664個上調基因和575個下調基因（圖3A）。并發現在Methy-High中，免疫反應、上皮間充質轉化（EMT）和多種信號通路（缺氧、糖酵解和血管生成）上調（圖3B，C）。雖然樣本量較小，但Methy-High腫瘤的免疫和基質評分往往高于Methy -Low腫瘤（圖3D，E）。為了更好地了解每個甲基化亞型的特征，使用TCGA-UCB數據集比較了UTUC和UCB的Methy-High和Methy-Low之間的基因表達，以及涉及獨特UCB亞型的一組功能途徑。發現甲基高UC腫瘤的特征是“basal”標記物上調。與Methy-Low亞型相比，Methy-High亞型的basal標記物、EMT標記物和血管生成標記物也上調（圖3F）。
5. Methy-High UC具有T細胞炎癥和免疫抑制環境
研究者使用TIP系統地評估了每個甲基化亞型的免疫表型，發現與Methy-Low亞型UC患者相比，Methy-High亞型UC患者的腫瘤抗原呈遞和免疫細胞向腫瘤的轉運增強，而Methy-Low亞型UC患者的T細胞識別癌細胞的能力減弱（圖4A）。在UTUC組和UCB組中，Methy-High患者的免疫細胞向腫瘤轉移的得分顯著較高（圖4B）。然而，在UTUC和UCB組中，Methy-High患者的T細胞識別癌細胞的得分較低（圖4C）。總的來說，這些結果表明Methy-High患者具有免疫抑制表型的炎癥腫瘤。為了更好地評估免疫細胞和基質細胞在調節每個甲基化亞型的免疫表型中的作用，進一步通過MCPcounter估算了腫瘤浸潤免疫細胞和基質細胞的豐度。并發現Methy-High亞型腫瘤浸潤性T細胞、B細胞和單核細胞的數量顯著高于Methy-Low（圖4D，E）。成纖維細胞和內皮細胞在Methy-High組均顯著高于Methy-Low UCB患者，在UTUC患者中也觀察到類似的趨勢（圖4D，E）。進一步證實，Methy-High患者浸潤性成纖維細胞和內皮細胞的比例高于Methy-Low患者（圖4F）。這些結果進一步表明，免疫細胞和基質成分在形成Methy-High UC患者的免疫抑制表型時具有高度參與性。與這些免疫反應特征和基質反應一致，在Methy-High亞型中，與抗原呈遞機制和細胞溶解活性以及免疫逃避標記物PD1、PD-L1、PD-L2和CTLA4相關的蛋白質表達顯著增加（圖4G）。此外，Methy-High亞型顯示泛成纖維細胞轉化生長因子b（TGFβ）反應信號（F-TBRS）基因的表達增強（圖4G），這是成纖維細胞中TGFβ途徑活性的指標，并與免疫治療的耐藥性有關。這些發現表明，激活的基質信號可能在Methy-High腫瘤的免疫抑制表型中發揮重要作用。進一步證實，Methy-High患者的免疫抑制評分高于Methy-Low患者（圖4H）。總的來說，這些結果表明，免疫治療和抗TGFβ治療的結合可能會改善Methy-High患者的臨床結果。
6. 用DNA甲基轉移酶抑制劑（SGI-110）處理T24和UMUC-3細胞顯示出治療效果
DNA甲基轉移酶抑制劑（DNMTis）已成為逆轉DNA高甲基化和相關基因沉默的新治療工具。研究者使用SGI-110處理T24和UMUC-3細胞，在無藥物培養基中培養細胞，分別通過傷口愈合和transwell實驗評估細胞遷移和侵襲能力。發現SGI-110處理顯著抑制兩種細胞系中的細胞遷移（圖5A，B）和侵襲能力（圖5C，D）。UMUC-3細胞比T24細胞對SGI-110處理更敏感（圖5）。總的來說，觀察到在停止SGI-110治療后細胞遷移和侵襲受到抑制，這可能解釋了SGI-110治療后觀察到的抗腫瘤作用。
7. 整合分析確定T24和UMUC-3細胞中的SGI-110靶基因
為了確定SGI-110的潛在治療價值，研究者評估了用SGI-110治療T24和UMUC-3細胞后的基因表達譜，發現SGI-110治療后上調的基因在多種抗腫瘤免疫途徑中顯著富集，如干擾素信號傳導、細胞因子/趨化因子、抗原處理和癌-睪丸抗原（圖6A）。SGI110治療上調的許多基因是抗腫瘤干擾素反應信號的一部分或下游，包括與抗原呈遞和細胞因子/趨化因子相關的基因（圖6B，C），還發現SGI110處理后，兩種細胞系中參與抗病毒活性的多個基因均上調（圖6D，E）。這種反應被稱為“病毒模擬”，因為細胞對外源性病毒感染的反應是一樣的。在SGI-110處理后，從轉座因子（包括SINE、LINEs和LTR）中識別出大量reads（圖6F，G）。這些發現與早期文獻報道一致，如LINE和SINE可能觸發AZA治療應答者的先天免疫系統激活。最后，還檢測了癌-睪丸抗原的基因表達水平，這也被認為在激活免疫系統和殺死癌細胞方面發揮重要作用。事實上，研究者觀察到T24和UMUC-3細胞中共享和細胞類型特異性癌-睪丸抗原上調（圖6H）。總之，SGI-110上調了多種抗腫瘤免疫途徑。
四、總結
綜上所述，該工作顯示UTUC和UCB中類似的潛在DNA甲基化圖譜。為臨床實踐提供了路線圖：DNA甲基化亞型分類可用于預測切除的UC患者的預后，并幫助確定哪些患者可能受益于基于順鉑的化療或使順鉑耐藥的癌細胞重新敏感。此外，也為SGI-110與免疫檢查點療法聯合治療UC提供了理論依據。文章一開始從DNA甲基化分子分型出發，逐步闡述各個不同亞型之間的特征，并且進行了實驗驗證，在每一個層面都進行了詳盡分析，文章故事邏輯清晰合理，并且該研究有收集新的樣本隊列，所以可以到10+。
